CEA特异性RNAi增强基因工程腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤

目的 研究癌胚抗原（CEA）特异性基因沉默对基因工程腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素。方法 利用RNA干扰(RNAi) 技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEA siRNA载体,通过基因转染, 在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型, H101瘤内注射。用RT-PCR和免疫组化法检测CEA在移植瘤中的表达,测量肿瘤体积。结果 降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和大小无明显影响,H101瘤内注射后,干扰组肿瘤体积显著低于空载体组和对照组（P＜0.05）。结论 抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达, 能增强H101的敏感性。     

RNA干扰缺氧诱导因子2对肾癌786-0细胞的影响

目的：研究RNA干扰缺氧诱导因子2（HIF-2）对肾癌786-0细胞的影响。方法:合成HIF-2 RNAi片段，将RNAi片段定向克隆于RNAi表达载体，测序鉴定；转染人肾癌786-0细胞, RT-PCR、Western 印迹法检测HIF-2 RNAi表达载体对HIF-2基因表达的影响，MTT法检测转染HIF-2 RNAi表达载体对细胞生长作用，裸鼠种植肿瘤观察RNA干扰组对肿瘤生长的影响。结果:RNA干扰组HIF-2mRNA的表达受到抑制，明显低于空载体组和对照组HIF-2mRNA的表达(P<0.01),空载体组HIF-2mRNA的表达没有受到影响；RNA干扰组的HIF-2蛋白表达明显降低，明显低于空载体组和对照组(P<0.01)，空载体组和对照组HIF-2蛋白的表达无显著差异；RNA干扰组细胞生长减慢,RNA干扰组肿瘤体积和瘤重均小于空白组(P<0.01)。结论:RNA干扰HIF-2可以抑制肾癌786-0细胞HIF-2的表达和抑制细胞生长，减慢裸鼠肿瘤的生长；为肾癌的生物治疗提供一定的实验基础。     

CNTN-1促进人食管癌EC9706细胞侵袭和迁移

目的探讨接触蛋白-1(CNTN-1)在食管癌转移中的作用。方法 q PCR和Western blot检测食管癌细胞系EC9706中CNTN-1的表达;RNA干扰和CNTN-1过表达质粒转染调整EC9706细胞CNTN-1的表达,并将细胞分为空白对照组、scrambled siRNA组、CNTN-1 siRNA组、pcDNA3.1-vector组和pcDNA3.1-CNTN-1组;Brd U和Transwell实验分别检测EC9706细胞增殖、侵袭和迁移能力;qPCR和Western blot检测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。结果 CNTN-1在食管癌细胞EC9706中mRNA和蛋白水平较与正常食管上皮细胞显著上调(P0.05);转染CNTN-1siRNA后,EC9706细胞CNTN-1表达水平显著降低(P0.05),细胞增殖、侵袭和迁移能力显著下降(P0.05),同时细胞中侵袭转移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达明显下降(P0.05);CNTN-1过表达质粒转染细胞后,EC9706细胞内CNTN-1表达水平上调(P0.05),细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高,同时MMP-2和MMP-9表达明显升高(P0.05)。结论 CNTN-1可能通过调节MMP-2和MMP-9表达促进食管癌细胞的侵袭转移。     

调控食管癌EC9706细胞DNA聚合酶β表达的初步研究

目的:观察DNA聚合酶β(DNA polβ)对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响。方法:以pSINsi-hU6为载体构建DNA polβ靶向的siRNA表达质粒,转染EC9706细胞,G418筛选。流式细胞术和裸鼠体内成瘤实验检测细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测细胞DNA polβmRNA的表达。结果:与空载体组和对照组相比,实验组1和实验组2(转染siRNA重组表达质粒)DNA polβmRNA的表达显著下降(P0.05),DNA polβ高表达组中mRNA的表达显著升高(P0.05);实验组1、实验组2和DNA polβ高表达组细胞周期S期比例显著增加(P0.05),肿瘤重量亦显著增加(P0.05)。结论:DNA polβ的高表达和过低表达,都会增加细胞的遗传不稳定性,可能在食管癌的发生中起一定作用。     

慢病毒载体介导Nanog小分子干扰核糖核酸抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长

目的构建对Nanog基因有干扰作用的慢病毒载体,探讨其在人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤模型中的表达,检测其对裸鼠移植瘤生长的影响。方法将前期细胞实验验证有效的siRNA序列构建于慢病毒载体中,制备携带shRNA-Nanog的慢病毒,同时构建胃癌裸鼠移植瘤模型。以lentivirus-shRNA-Nanog感染的裸鼠作为实验组(目的组),以无关序列慢病毒感染的裸鼠(空载体组)及未感染的裸鼠(未感染组)作为对照组,测量肿瘤瘤体体积及质量的变化;活体荧光成像观察总荧光强度及转移情况,Western blot法检测移植瘤组织中Nanog蛋白的表达情况;TUNEL法观察其对皮下移植瘤细胞凋亡的影响。结果经基因测序鉴定,Nanog基因shRNA重组慢病毒表达载体构建成功。活体荧光成像显示感染27 d后,目的组小鼠肿瘤总荧光强度明显低于空载体组和未感染组,裸鼠移植瘤瘤体积及瘤质量小于未感染组及空载体组;Western blot法显示目的组Nanog蛋白表达较对照组明显降低;TUNEL结果显示目的组凋亡指数较对照组明显增大,而空载体组与未感染组比较,差异无统计学意义。结论成功构建了Nanog基因shRNA表达载体并包装成慢病毒颗粒,在体内感染能明显抑制肿瘤生长。     

沉默激酶功能区受体抑制前列腺癌PC-3细胞的裸鼠体内成瘤能力

目的 研究激酶功能区受体(KDR)基因表达沉默后对前列腺癌PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响.方法 将15只5周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为干扰组、阴性质粒组和未转染组,每组5只.分别接种构建的pSilencer 3.1-KDR siRNA表达质粒转染PC-3细胞、阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞以及未转染的PC-3细胞于裸鼠皮下;观察各组PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率、瘤体生长速度以及平均瘤质量等方面的变化,RT-PCR和Western blot技术检测瘤体KDR基因和蛋白表达.结果 pSilencer3.1KDR质粒转染组的裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组;与未转染组和PSilencer3.1-NC组相比,pSilencer3.1-KDR组肿瘤的生长受到明显抑制,平均体积较小(0.28 cm3 vs 0.721 cm3,0.715 cm3,P＜0.01),平均瘤质量较轻(0.14g vs 0.648g,0.635g,P＜0.01);裸鼠肿瘤组织中KDR mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 RNAi介导的KDR基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内的瘤体生长速度,KDR有可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

HIF-1α对食管癌Eca109细胞体内外侵袭转移的影响及其分子机制

目的:采用RNA干扰技术(RNAi)观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对食管癌Eca109细胞及其裸鼠移植瘤侵袭转移的影响及其作用机制。方法:CoCl2模拟肿瘤低氧微环境,分别用RT-PCR和免疫细胞化学法检测体外低氧条件下Eca109细胞中HIF-1α、E-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA及蛋白的表达。RT-PCR检测RNAi沉默HIF-1α对E-钙黏蛋白及MMP-2 mRNA表达的影响。通过细胞划痕试验和Transwell试验检测RNAi对Eca109细胞侵袭和转移能力的影响。建立Eca109细胞裸鼠移植瘤模型,观察HIF-1α对肿瘤生长及淋巴结转移的影响;采用Western blot检测各组移植瘤中HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2的表达,分析HIF-1α在离体和在体对肿瘤生长、侵袭及转移的影响。结果:低氧诱导Eca109细胞的HIF-1α蛋白表达升高,E-钙黏蛋白的mRNA及蛋白表达降低和MMP-2 mRNA及蛋白表达升高,但对HIF-1αmRNA无明显影响。用RNAi能有效沉默HIF-1α,并可逆转低氧导致的E-钙黏蛋白及MMP-2的降低及升高,使Eca109细胞迁移速度减慢,侵袭穿膜细胞数减少(P<0.05);在体内使移植瘤生长减缓,淋巴结转移率降低(P<0.05)。结论:HIF-1α在体内外通过影响E-钙黏蛋白和MMP-2表达,来影响食管癌Eca109细胞的生长、侵袭和转移。     

抑制EGF-1受体表达对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生物学行为的影响

目的诱导IGF-I受体基因沉默的shRNA真核表达质粒的在体抗瘤效应,探讨RNA干扰IGF-I受体基因对裸鼠人鼻咽癌移植瘤的生物学行为的影响。方法将右侧背部接种人鼻咽癌CNE2细胞后,肿瘤直径达5～7mm的24只裸鼠随机分为3组:A组为IGF-1RmRNA特异性真核表达质粒(pshRNA1)治疗组,瘤体内多点注射pshRNA1;B组为pshRNA2质粒载体对照组,瘤体内多点注射阴性质粒载体pshRNA2(剂量同A组);C组为生理盐水对照组,瘤体内多点注射0.3ml生理盐水。从开始治疗后3周处死裸鼠,分离肿瘤,部分做共聚焦观察质粒转染情况,其余肿瘤组织观察肿瘤组织的病理变化和IGF-I受体蛋白在瘤体内的表达变化。结果所有裸鼠移植瘤接种成功,14d左右肿瘤直径达5～7mm。治疗裸鼠7d后,pshRNA1治疗组抑制率达67.21%,瘤体积明显小于阴性质粒组和生理盐水组(P<0.05),阴性质粒组与对照组无显著差异。pshRNA1治疗组移植瘤可见大片癌组织表达绿色荧光,其中仅少数细胞为IGF-IR阳性细胞。阴性质粒组癌组织也表达绿色荧光,但IGF-IR阳性细胞数明显多于pshRNA1治疗组(p<0.05),而生理盐水组的移植瘤未见绿色荧光。结论shRNA干扰IGF-I受体基因能在体内有效下调IGF-I受体蛋白的表达、抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长。     

siRNA特异沉默卵巢癌细胞CD59基因的裸鼠移植瘤研究

目的:通过体内动物实验研究CD59-siRNA对卵巢癌细胞CD59的沉默效应及抑瘤作用,探讨CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.方法:将转染CD59干扰质粒的A2780细胞(T组)、转染空质粒的A2780细胞(V组)及未转染的A2780细胞(C组)分别接种于裸鼠皮下,通过绘制肿瘤生长曲线,裸鼠移植瘤组织切片CD59 mRNA原位杂交及CD59蛋白的免疫组化研究其抑瘤效应及对CD59的沉默效应.结果:肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,CD59干扰质粒转染组肿瘤生长明显受抑制(P<0.05).原位杂交及免疫组化结果表明,干扰组的CD59 mRNA及CD59蛋白与对照组相比显著降低(P<0.05).结论:裸鼠体内实验表明,特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达,增加了卵巢癌细胞对补体攻击的敏感性,从而抑制卵巢癌在体内的生长,进一步说明了CD59在肿瘤免疫逃逸中的作用.     

骨母细胞特异性因子2介导间充质干细胞调控瘢痕疙瘩样瘤体生长的研究

目的探讨骨母细胞特异性因子2(Periostin)调控瘢痕疙瘩间充质干细胞(KMLSCs)对体外及裸鼠体内瘢痕疙瘩样瘤体生长的影响。方法从瘢痕疙瘩中分离培养KMLSCs,设置实验Periostin干扰组、空载体组和未转染组,根据干预目的构建Periostin慢病毒载体并转染对应组细胞。利用Western Blot技术体外检测各组细胞Periostin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况;制备丝素蛋白-壳聚糖支架复合体,与细胞共培养后,扫描电镜观察支架的结构、KMLSCs的生长情况。建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩样瘤体移植模型,移植8周后取出瘤体,测量3组肿瘤体积,通过荧光共聚焦技术检测各组组织中Periostin、α-SMA、VEGF以及Western Blot技术评估Erk的表达情况。结果体外培养的3组KMLSCs中Periostin在空载体组和未转染组有表达,而干扰组则表达微弱;同时3组细胞均不表达α-SMA和VEGF。制备的支架复合体呈多孔结构,KMLSCs在复合体支架中生长良好;各分组瘤体移植模型在体内裸鼠皮下成活良好。干扰组中Periostin表达下调后,瘤体体积显著减小,同时α-SMA、VEGF、Erk表达减弱,差异有统计学意义(P 0. 05),并呈现一致性。结论 Periostin可能通过调控KMLSCs的功能,参与了模型中瘢痕疙瘩样肿块的生长。     

凋亡诱导因子介导TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡

目的探讨TAp63γ诱导的人食管鳞癌细胞株EC9706细胞凋亡的分子机制。方法用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测食管鳞癌EC9706细胞中凋亡诱导因子（AIF）和p63的表达;将质粒pcDNA3．1-TAp63γ转入EC9706细胞,流式细胞仪检测凋亡率,并用激光共聚焦显微镜和亚细胞器分离技术观察分析AIF的转位;采用RNA干扰技术下调AIF的蛋白表达水平,caspase广谱抑制剂zVAD．fmk预处理细胞,再用流式细胞仪分析EC9706细胞表达TAp63γ后凋亡率的变化。结果EC9706细胞中AIF表达且定位在细胞质中,p63基因的表达亚型是ANp63,TAp63γ不表达;在pcDNA3．1-TAp63γ转染组和pcDNA3．1-p53转染组的细胞质及细胞核蛋白中分别检测到AIF,pcDNA3．1转染组的胞核蛋白无AIF信号;pcDNA3．1转染组、pcDNA3．1-TAp63γ转染组、AIF—siRNA干扰后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组、zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp63γ组和AIF-siRNA干扰联合zVAD．fmk处理后再转染pcDNA3．1-TAp631组的凋亡率分别为1．37％、13．64％、4．52％、4．03％和1．91％。结论TAp63γ在诱导EC9706细胞凋亡的过程中,AIF从线粒体释放入胞质并转位到细胞核内;下调AIF的蛋白表达水平可降低TAp631诱导的细胞凋亡;TAp631诱导的细胞凋亡依赖于AIF和caspase。     

食管癌细胞放射诱导前后化疗敏感性变化及相关机制研究

目的： 探讨食管癌细胞放射诱导前后对化疗药物敏感性及耐药基因ERCC1表达的变化，分析ERCC1的表达与化疗敏感性变化的关系。方法: 采用［60Co］-γ射线反复多次照射食管癌细胞株EC9706，建立放射抗拒食管癌细胞株EC9706-R。MTT法测定EC9706和EC9706-R对顺铂的IC₅₀,计算耐药指数。免疫细胞化学(SP)和RT-PCR法测定ERCC1蛋白和mRNA在2种细胞中的表达。结果: EC9706细胞对顺铂的IC50是(1.480±0.012) mg/L，EC9706-R细胞的IC₅₀是1.836±0.008 mg/L(P<0.05)，耐药指数为：1.240±0.015；ERCC1蛋白在2种细胞中染色强度指数分别为2.838±0.055和2.898±0.039，两者无统计学差异(P>0.05)。ERCC1在这2种细胞中mRNA表达的特异性基因条带与β-actin基因条带的密度比值分别为：1.168±0.068和1.143±0.089（P>0.05）。结论: 诱导建立的食管癌放射抗拒细胞较亲本细胞的化疗敏感性下降,而耐药基因ERCC1的表达水平不随细胞对放化疗敏感性的变化而变化。     

食管癌细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系

目的：探讨食管癌鳞癌EC9706细胞系细胞表面DR5的表达分布与细胞铺展状态的关系。方法：免疫细胞化学技术分析食管癌EC9706细胞的DR5表达分布；流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5的表达及细胞的凋亡率。结果：DR5分布在食管癌EC9706细胞的细胞质和细胞膜表面，主要在细胞质，但在细胞核没有DR5分布，而且在悬浮的食管癌细胞表面DR5表达高于铺展者。悬浮的食管癌细胞对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性高于铺展者。结论：食管癌细胞表面DR5的表达与细胞铺展状态具有密切的关系，细胞铺展状态的变化直接影响细胞表面DR5的表达分布以及对抗DR5功能性抗体诱导的细胞凋亡敏感性。该研究结果对进一步探讨DR5表达分布的机制以及TRAIL和DR5的功能性抗体的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义。     

Human esophageal fibroblast-derived exosomal miR-21 reduced the cisplatin sensitivity to esophageal carcinoma EC9706 cells

The objective of this study was to investigate the effect of human esophageal fibroblast-derived exosomal miR-21 on cisplatin sensitivity against esophageal squamous EC9706 cells. EC9706 cells were co-cultured indirectly with human esophageal fibroblasts (HEF) or miR-21 mimics transfected-HEF in the transwell system. The exosomes in HEF-culture conditioned medium were extracted by differential ultracentrifugation. EC9706 cells were co-cultured with HEF-derived exosomes directly. The cisplatin sensitivity against EC9706 cells was revealed via half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values using MTT assay. The expressions of miR-21, programmed cell death 4 (PDCD4) mRNA, and gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten (PTEN) mRNA were determined by qRT-PCR. The changes of the protein level were detected using western blot assay. IC₅₀ values of cisplatin against EC9706 cells were increased after EC9706 cells were co-cultured with either HEF or exosomes derived from miR-21 mimics-transfected HEF. Following the increased level of miR-21, the mRNA expression and protein levels of PTEN and PDCD4 were decreased in EC9706 cells. The cisplatin sensitivity to EC9706 cells was reduced by HEF-derived exosomal miR-21 through targeting PTEN and PDCD4. This study suggested that non-tumor cells in the tumor micro-environment increased the tumor anti-chemotherapy effects through their exosomes.     

热休克蛋白70在人食管癌EC9706细胞凋亡过程中的表达与定位变化

目的 探讨姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用,热休克蛋白70(HSP70)在肿瘤细胞凋亡过程中在核基质上的变化及其与凋亡调控相关蛋白的关系.方法 用细胞计数和流式细胞仪检测姜黄素对人食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用,以光学显微镜和透射电镜观察姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡前后的细胞结构变化,琼脂糖凝胶电泳观察人食管癌EC9706细胞凋亡前后的DNA结构变化.双向凝胶电泳和质谱鉴定分析HSP70在核基质中的存在与变化;并以Western blotting进行确证;激光扫描共焦显微镜观察HSP70在EC9706细胞凋亡过程中的定位及其与Bax、Bcl-2等基因产物的共定位关系.结果 姜黄素能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖并诱导人食管癌EC9706细胞凋亡,双向凝胶电泳、质谱鉴定和结果 发现并证实,HSP70在姜黄素处理前后的EC9706细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.激光扫描共焦显微镜观察结果 显示,HSP70在EC9706细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.结论 姜黄素对人食管癌EC9706细胞具有显著的凋亡诱导作用;HSP70作为一种新发现的核基质蛋白,在姜黄素诱导人食管癌EC9706凋亡过程中的表达与分布发生了显著变化.HSP70与凋亡相关基因的关系对EC9706细胞凋亡具有重要影响.     

环氧合酶-2选择性抑制剂NS-398抑制肿瘤细胞的作用机制

目的:探讨COX-2选择性抑制剂NS-398对肿瘤细胞抑制的作用机制。方法:选择持续表达COX-2的人食管癌细胞株EC9706和不表达COX-2的肝癌细胞株SMMC7721作为研究对象，采用［3H］-TdR掺入法检测不同浓度（10、20、50、100 μmol/L）NS-398和作用24 h、48 h、72 h对细胞的增殖抑制效应；流式细胞术（FCM）及DNA片段分析法检测NS-398诱导的细胞凋亡情况；免疫细胞化学方法检测NS-398作用后细胞内survivin表达变化。结果:经不同浓度的NS-398处理，EC9706及SMMC7721的［3H］-TdR掺入量均明显少于空白对照组（P<0.05或P<0.01），具有时间和剂量-效应关系。FCM检测发现EC9706在G1期前出现亚倍体凋亡峰，细胞凋亡率达(45.23±1.08)%，并出现典型的细胞凋亡梯带；而SMMC7721无凋亡峰出现，细胞凋亡率为(3.05±0.15)%，两组比较有显著性差异（P<0.01）。经100 μmol/L NS398作用24 h后，EC9706细胞内survivin表达与未经NS-398作用的EC9706细胞表达明显减少，而SMMC7721表达无变化。结论:NS398通过不同作用机制对肿瘤细胞发挥抑制作用，对COX-2表达阳性的肿瘤细胞具有诱导凋亡作用，与抑制survivin表达有关，而对无表达COX-2的肿瘤细胞无诱导凋亡作用。     

人食管鳞癌细胞系EC9706的建立及其比较基因组杂交分析

目的 以中国男性食管鳞癌为来源，建立一个可良好传代的细胞系，从而提价七个有用的体外模式用于食管癌的研究。方法 采用组织块培养法，以新鲜的食管癌组织细胞系EC9706，做了初步的生物学特性观察，并采用比较基因组杂交的方法进行细胞遗传学的检测。结果 食管癌细胞系EC9706生长曲线显示其生长良好，易于培养。传代时间为26h，平皿集落形成率为91．9％，且能够在软琼脂中形成集落。经异种接种到裸鼠中均形成移植性肿瘤，肿瘤的病理诊断为中－低分化鳞状细胞癌。比较基因组杂交结果得出染色体1p1,q2-4,2p1,5p,7p14,7q21,11q1,11q2,20q扩增，其中5p表现出高水平的扩增。而染色体2p2,2q2,3p,4,9p,14,18,Xq缺失。结论 建立的细胞系EC9706可用于研究食管癌的癌变过程。