载体法筛选人巨细胞病毒截短UL54基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 建立载体法筛选人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54基因(UL54S)小干扰RNA(siRNA)靶位的体系.方法 利用质粒pAVU6+27设计并构建2个小发夹RNA(shRNA)表达载体(psiUL54-1和psiUL54-2),与融合蛋白表达载体pUL54S-绿色荧光蛋白(EGFP)共转染AD293细胞.荧光显微镜观察融合蛋白荧光表达,RT-PCR法分析UL54S mRNA水平变化,流式细胞仪评价siRNA对融合蛋白的抑制作用,采用方差分析对流式细胞检测结果进行统计分析,筛选出有效的siRNA作用靶位.结果 shRNA表达载体psiUL54-2与融合蛋白表达载体pUL54S-EGFP共转染AD293细胞48 h后,pUL54S-EGFP、psiUL54-2共转染组EGFP表达量较pUL54S-EGFP、pAVU6+27共转染组下降;凝胶分析显示,psiUL54-2与pUL54S-EGFP共转染48 h后,UL54SmRNA相对表达量为19.6,明显低于pUL54S-EGFP、psiUL54-1共转染组的96.6与对照组的100.0;psiUL54-1、pUL54S-EGFP共转染48 h后对融合蛋白UL54S-EGFP表达无影响(P>0.05),但psiUL54-2、pUL54S-EGFP共转染抑制融合蛋白UL54S-EGFP的表达(19.43×104±2.29×104比27.89×104±5.50×104,P<0.01).结论 成功建立载体法筛选HCMV截短UL54S siRNA靶位体系,UL54S序列中1532～1550位点是有效的siRNA靶位点.     

RNA干扰抗乙型肝炎病毒的研究进展

目前，慢性乙型肝炎的治疗仍以抗病毒为主，但疗效均不理想，因此寻求一种新的有效抑制HBV的方法显得十分重要，而RNA干扰（RNAi）技术为这一构想提供了可能。RNAi是指由21～23个核苷酸组成的双链RNA（dsRNA）所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象。现认为RNAi主要发生在RNA水平，较早应用于抗RNA病毒的研究中，如抗HCV、HIVH0等，并取得了十分理想的效果。自2003年起陆续有学者利用RNAi技术对DNA病毒如HBV开始进行研究。     

用siRNA表达框架抑制CYP450 2E1基因转录筛选高效的RNA干扰位点及构建该位点的siRNA表达载体

目的：寻找高效抑制P450 2E1因转录的位点，构建该位点的siRNA的表达载体。 方法：参照Harborth J的方法，选择siRNA的4个靶位点，用LineSilence TN^RNA干扰转录试剂盒产生PCR的扩增产物作为表达框架，直接转染E47细胞，产生siRNA抑制CYP450 2E1基因转录，筛选高效抑制P450 2E1基因表达的位点，以筛选出的高效位点构建BS／U6／CYP2E1表达质粒，转染E47细胞，观察该质粒在E47细胞中发生RNAi的效果。     

RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSuper-C，观察其对HepG2 2．2．15细胞(简称2、2．15细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。方法 根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对HBV核心区的相应序列，再将其克隆入含聚合酶ⅢH1-RNA启动子的真核表达载体pSuper，将此重组质粒以电转染法转入2．2．15细胞中，用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明，成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper-C；但以电穿孔法转染 2．2．15细胞后末能发现其对2．2．15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。结论 RNAi在2．2．15细胞中的作用还需进一步的实验来证实。     

靶向载脂蛋白M基因小干扰RNA表达载体构建及其功能

目的设计和构建载脂蛋白M基因特异性的小干扰RNA体内表达载体,筛选抑制载脂蛋白M表达的有效小干扰RNA,并初步探讨载脂蛋白M的功能。方法以载脂蛋白M为目的基因,以产生小干扰RNA质粒载体pSilencerTM2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条小干扰RNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-载脂蛋白。将重组质粒载体plucF-载脂蛋白与产生小干扰RNA的质粒pSilencerTM2.1-U6共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效小干扰RNA,然后将小干扰RNA转染L-02,逆转录聚合酶链反应检测载脂蛋白M mRNA的表达,进一步证实小干扰RNA对载脂蛋白M表达的抑制效果,酶联免疫吸附法检测有效小干扰RNA对载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B和载脂蛋白E合成和分泌的影响。结果合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为86%和91%,并特异性抑制肝细胞载脂蛋白M mRNA的表达;有效小干扰RNA能够有效抑制载脂蛋白AⅠ合成和分泌(P<0.05),而载脂蛋白B和载脂蛋白E的含量无明显改变(P>0.05)。结论成功构建并筛选到针对载脂蛋白M基因表达的有效小干扰RNA质粒,为研究冠心病的发病机制奠定基础。     

靶向Akt2基因RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的 利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法 利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6为引物进行PCR鉴定,对表达载体pRNAT-U6.2及亚克隆产物进行双酶切,将得到的基因及线性化的表达载体再次连接,利用PCR方法进行重组体的筛选鉴定并进行测序分析.结果 将合成的DNA序列克隆到表达载体上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列.结论 Akt2靶向RNA干扰重组表达载体构建成功.     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

乙型肝炎病毒S基因重组逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达

目的 探索逆转录病毒载体在基因治疗中的应用。方法 用ＤＮＡ重组技术构建ＨＢＶ－Ｓ基因重组逆转录病毒载体,电穿孔转染ＰＡ３１７后,筛选高表达克隆,用假病毒颗粒感染ＨｅｐＧ２、Ｐ８１５和ＥＬ４细胞,分别用ＲＴ－ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ法检测目的基因表达。结果 ＨＢｓＡｇ在上述细胞中获得不同程度的表达,细胞上清液（４８ｈ）中ＨＢｓＡｇ含量（吸光度值）分别为０．９２、０．０９和０．４７。结论 逆转录病毒用载体,     

HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.     

针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

聚合酶链反应扩增小分子干扰RNA表达框筛选抑制HBV DNA复制的小分子干扰RNA

一些短片段的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。小分子干扰RNA（siRNA）就是这种短片段双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。本研究针对HBV DNA多聚酶区的siRNA，运用PCR扩增siRNA表达框的方法筛选出对HBV DNA抑制作用最强的siRNA，观察其对HBV DNA复制及HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。     

靶向HBx基因shRNA载体稳定表达人肝癌细胞的建立

本研究采用整合有HBV DNA而HBsAg表达阴性的人肝癌细胞株MHCC97-H,应用免疫荧光法初步研究HBx表达,并从基因组中克隆HBx基因,采用RNA干扰(RNAi)技术,构建靶向该HBx基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,通过转染和筛选,研究shRNA载体在MHCC97-H细胞中稳定表达对HBx基因表达的影响,最终构建稳定表达靶向整合HBx基因的shRNA载体的人肝癌细胞模型,为进一步研究构建平台.     

靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选

目的构建靶向木糖转移酶-1（XT-1）的短发卡状小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。     

针对HBV S基因发夹状siRNAs表达载体的构建及其在HepG2215细胞中对HBV基因表达的抑制作用

目的探讨通过载体在体外培养的细胞中表达发夹状siRNAs对HBV基因表达的抑制作用。方法构建表达针对HBV S基因mRNA的发夹状siRNAs的质粒pSilencer 2.1-U6-S,并与ayw亚型HBV全基因组表达质粒共转染体外培养的HepG2215细胞,用半定量RT-PCR分析目标mRNA表达丰度的变化,用ELISA法观察HBsAg表达的变化。结果siRNA处理组细胞上清中HbsAg和HBeAg含量分别比空白对照组降低了63.4%和68.0%,细胞中的2.1kb的信使RNA降低了75.2%。结论siRNA在体外培养的细胞中能有效地抑制HBV基因的表达。     

La蛋白与乙型肝炎病毒mRNA稳定性和蛋白质表达的相关性

目的研究La蛋白与乙型肝炎病毒（HBV）mRNA稳定性和蛋白质表达之间的相关性。方法设计并合成La蛋白mRNA特异性小干扰RNA（siRNA），转染HepG2．2．15细胞，继续培养3d后分别裂解转染和未转染siRNA的细胞l抽提蛋白质，Westernblot检测La蛋白含量变化；于转染后的第1、2、3、5、7、9天分别收集细胞培养上清液，实时荧光定量聚合酶链反应技术检测上清液中HBVDNA的变化情况，电化学发光分析技术检测乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎e抗原含量变化情况。结果La蛋白在转染siRNA的HepG2．2．15细胞中表达明显低于未转染siRNA的细胞；转染siRNA的细胞分泌到上清液中乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和HBVDNA的含量也明显低于未转染siRNA的细胞。结论在HepG2．2．15细胞内，La蛋白与HBVmRNA稳定性和蛋白质表达具有功能相关性。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

siRNA for Influenza Therapy

Influenza virus is one of the most prevalent and ancient infections in humans. About a fifth of world's population is infected by influenza virus annually, leading to high morbidity and mortality, particularly in infants, the elderly and the immunocompromised. In the US alone, influenza outbreaks lead to roughly 30,000 deaths each year. Current vaccines and anti-influenza drugs are of limited use due to high mutation rate of the virus and side effects. In recent years, RNA interference, triggered by synthetic short interfering RNA (siRNA), has rapidly evolved as a potent antiviral regimen. Properly designed siRNAs have been shown to function as potent inhibitors of influenza virus replication. The siRNAs outperform traditional small molecule antivirals in a number of areas, such as ease of design, modest cost, and fast turnaround. Although specificity and tissue delivery remain major bottlenecks in the clinical applications of RNAi in general, intranasal application of siRNA against respiratory viruses including, but not limited to influenza virus, has experienced significant success and optimism, which is reviewed here.     

应用shRNA研究乙型肝炎病毒X基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞p53表达和活性的影响

目的应用短发夹状RNA介导的RNA干扰研究乙型肝炎病毒X基因（HBX）和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞p53表达和活性的影响。方法以2μmol／L As2O3处理HepG2细胞和表达HBX的HepG2-X，以未处理细胞为对照，提取细胞裂解物或胞核裂解物，采用改进的酶联免疫吸附法检测p53总量和相对活性吸光度。应用脂质体介导具有HBX序列特异性短发夹状RNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3转染HepG2-X，再次观察As2O3处理对D53表达和活性的影响。结果As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性。短发夹状RNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。结论As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。应用短发夹状RNA介导的RNA干扰有利于研究HBX的表达对p53表达和活性的影响。HBX表达上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性。     

应用RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默(PTGS)过程中,与双链RNA有同源序列的单链RNA(如mRNA)被降解,从而阻断基因表达。RNAi过程的关键是由双链RNA