羌活药材ITS/ITS2条形码鉴定及其稳定性与准确性研究

为验证DNA条形码鉴定的稳定性与准确性,本文选用羌活药材作为研究对象,对31份样本提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列并进行双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,采用MEGA5.0软件与其混伪品进行序列比对,计算种内和种间距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ Tree)。ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型(hidden Markov model,HMMer)的注释方法获得。结果表明,羌活药材ITS序列长度为603～604 bp,ITS2序列长度均为228 bp,羌活药材ITS/ITS2序列单倍型与其基原植物叶片序列一致。两种基原植物ITS/ITS2序列种内平均kimura 2-parameter(K2P)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;NJ树结果显示羌活、宽叶羌活与其混伪品均可明显区分,表现出良好单系性。因此ITS/ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别羌活药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

为评价DNA条形码候选序列对重楼属药用植物的鉴定作用, 探讨重楼属药用植物鉴定新方法, 本研究对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行PCR扩增和测序, 比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异, 进行barcoding gap分析, 采用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示, ITS2序列在所研究的重楼属药用植物中的扩增和测序效率均为100%, 其种内种间变异、barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势, ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%, 而生物条形码协会 (CBOL) 植物工作组推荐的matK和rbcL序列的鉴定成功率分别为52.9% 和5.9%, 二者联合鉴定能力没有提高, 对于ITS2序列扩大至29个物种67份样品依然具有100%的鉴定成功率。实验结果表明, ITS2序列能够准确鉴定重楼属药用植物, 可以作为潜在的药用植物通用条形码序列。     

基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品,保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序,测序结果经Codon Code Aligner软件校对,同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中,ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列,共得到16个物种的ITS2序列50条;经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列,计算所有物种种内和种间遗传距离,构建邻接法(neighbor joining,NJ)聚类树,通过ITS2 Database预测ITS2二级结构,采用4Sale软件比对二级结构,通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining,PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致,可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码,ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果,为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

基于ITS2序列的三棱及其混伪品的分子鉴定

摘 要 目的：通过分析三棱及其混伪品的ITS2条形码序列,探索鉴定三棱及其混伪品的新方法。方法: 采集三棱及其混伪品共5个物种8个样本,并从Genbank网上下载三棱及其混伪品共6个物种23条ITS2序列,用MEGA5.0软件计算上述ITS2序列的种间、种内遗传距离,并构建系统发育树。结果: 三棱种内最大K2P距离为0.038,与混伪品种间最小K2P距离为0.697。由所构建的系统发育树可以看出,正品三棱的不同样品聚在一支,并能很好地与混伪品区分开。结论:ITS2条形码序列能够成功鉴定三棱与其混伪品,为三棱及其混伪品的鉴别提供了新的方法。     

陕西关中野生商陆资源的ITS2和psbA-trnH条形码序列研究

为探讨DNA条形码在陕西关中野生商陆资源中的鉴定作用,本研究采用通用引物ITS2和psbA-trnH对29份商陆样品DNA进行PCR扩增和测序,用Codon CodeA-ligner V3.0进行序列拼接和校对,随后进行BLAST比对鉴定分析;同时运用MEGA 6.0分析序列特征、K2P遗传距离及种内或种间变异,并构建系统进化树,评价两对引物对该区域商陆及其混伪品的鉴别能力。研究结果表明, ITS2和psbA-trnH序列的PCR扩增和测序成功率均为100%; NJ系统进化树显示ITS2和psbA-trnH序列均可明显将所有样本分别聚为商陆、垂序商陆并与其同属近源种鄂西商陆、日本商陆及两种混伪品各自聚为不同分支; ITS2序列在种间遗传距离上较psbA-trnH有一定优势。ITS2和psbA-trnH序列均可作为DNA条形码对商陆及其混伪品进行识别和鉴定,为商陆资源品种现状与分布研究及合理开发利用提供理论依据。     

巴戟天饮片及其混伪品的鉴别研究

目的:基于DNA条形码技术、传统经验鉴别和理化鉴别技术区分巴戟天饮片及其混伪品。方法:通过聚合酶链式反应(PCR),对巴戟天的内部转录间隔区2(ITS2)序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行BLAST比对,以及利用构建NJ树的方法推断巴戟天饮片及其混伪品的基原;比较巴戟天饮片及其混伪品的种内、种间差异;比较巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为差异。结果:巴戟天饮片及其混伪品经NJ树聚类分析和与GenBank进行BLAST比对,结果显示巴戟天饮片与其混伪品分支明显,11批巴戟天混伪品被鉴定到7个种,分别为印度羊角藤(羊角藤)、蔓虎刺、硃砂根、木通、黑老虎、合蕊五味子(铁箍散)、南五味子;种内、种间变异分析结果显示,5批巴戟天饮片的种内遗传距离为0.000,巴戟天饮片与其他7个混伪品的最小种间遗传距离为0.037;巴戟天饮片及其混伪品的性状和薄层色谱行为存在差异。结论:基于DNA条形码技术可有效区分巴戟天饮片及其混伪品,为巴戟天饮片正伪品的鉴别以及标准提升工作提供了一定的依据。     

ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前

目的：建立以ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前及其同属近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。方法：搜集徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品,采用改良的CTAB法提取DNA,通过实验分别获得ITS2和psbA-trnH序列,将同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到43条ITS2+psbA-trnH复合序列,从GenBank数据库中下载来源于同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到14条ITS2+psbA-trnH 网上复合序列,用MEGA 6.05软件分析徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品的复合序列变异位点,计算种内、种间的K2P距离,并构建NJ系统聚类树。结果：徐长卿、白薇和白前药材ITS2+psbA-trnH复合序列比对后产生17个变异位点;徐长卿、白薇和白前基源物种种内最大K2P距离均小于其与混伪品的种间最小K2P距离;系统NJ树能准确将徐长卿白薇和白前及其近缘混伪品。结论：该研究建立了应用ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇、白前及其近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。     

基于ITS2序列及二级结构对药用黄芪及混伪品的鉴别研究

为了有效地进行药用黄芪及其混伪品的分类鉴定,本实验对收集的蒙古黄芪、膜荚黄芪共32份材料进行了ITS2序列的扩增及双向测序,测序结果经CExpress软件拼接,去除两端5.8S和28S序列后,获得完整的ITS2序列;并从GenBank上下载黄芪混伪品蓝花棘豆、锦鸡儿、红芪、蜀葵的ITS2序列各3条,利用MEGA7计算种内、种间遗传距离,对各序列进行差异性分析;利用Neighbor-joining (NJ)法基于ITS2序列(一级结构)和基于联合ITS2序列及其二级结构构建系统发育树。结果表明:蒙古黄芪与膜荚黄芪平均ITS2序列长度均为216 bp,平均GC含量分别为50.00%、50.46%,两种药用黄芪与蓝花棘豆在ITS2序列的长度和GC含量的相似性最高,与蜀葵存在较大的差异;药用黄芪与蓝花棘豆的种间距离最小,与红芪、锦鸡儿、蜀葵遗传距离较大;基于ITS2序列(一级结构)和基于联合ITS2序列与其二级结构构建的系统发育树表明:两种系统发育树的拓扑关系基本一致,都可以有效地鉴别药用黄芪及其混伪品;此外二级结构信息的加入,也使得ITS2序列在构建系统发育树中末端分支变多,分辨率与支持率上...     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品

建立了基于ITS2序列鉴别维吾尔药材薰衣草及其混伪品(全叶青兰和夏枯草)的方法.对维吾尔药材薰衣草及其混伪品的ITS2 序列进行PCR扩增和双向测序,使用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行序列拼接,用MEGA 6.0 软件对拼接后的序列进行多重比对.并计算种内、种间遗传距离,构建NJ 系统聚类树,预测...     

DNA条形码鉴定洋金花及其伪品

为建立有毒中药洋金花及其伪品DNA条形码鉴定方法,采用国际通用的条形码序列ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL对洋金花原植物白花曼陀罗及其伪品毛曼陀罗、曼陀罗和木本曼陀罗4个种共计20份材料进行了比较研究。PCR及测序成功率分别为ITS2(100%)、matK(100%)、psbA-trnH(90%)、rbcL(85%)。采用CodonCode Aligner进行序列拼接,采用MEGA 4.1计算白花曼陀罗及其伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树。结果显示ITS2序列共有30个单核苷酸多态性(SNPs)位点、psbA-trnH序列有33个单碱基的插入和缺失I。TS2和psbA-trnH序列种间遗传距离大于种内,matK和rbcL种内和种间没有明显Barcoding Gap。4个条形码序列及其组合获得的分子系统树(ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、matK+rbcL)均分成了两大支,木本曼陀罗单聚为一支,该分子证据支持将Brugmansia提升为属水平。实验结果表明ITS2及psbA-trnH序列可以作为洋金花及其伪品鉴定用的条形码序列。     

市售覆盆子药材DNA条形码鉴定研究

目的基于ITS2条形码序列检测市场销售覆盆子药材,为保证覆盆子药材使用的正确性和安全性提供一种新的鉴定手段。方法获取掌叶覆盆子及其5种常见同属易混种ITS2序列,以及GenBank上下载的共计48条序列。使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度,GC含量和变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA 7.0软件计算遗传距离和构建邻接系统发育聚类树。同时随机检测24份市售覆盆子药材,利用中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。结果掌叶覆盆子基原植物可与其同属易混种进行明显区分;市售药材中正品22份,伪品1份,混合物1份。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术能够成功鉴定市场销售的掌叶覆盆子及其混伪品。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定.方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon?Code?Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析...     

菊科藏药材及其近缘物种的分子鉴别

目的 评估ITS2(internal transcribed spacer 2)序列作为DNA条码鉴定菊科藏药材及其近缘物种的能力。方法 于西藏自治区等地采集菊科植物样本50份,共26个物种,分布于8个属,它们大部分可以用作藏药材。采用遗传距离比较法和系统聚类树法评估ITS2序列的鉴定能力。首先,采用试剂盒法提取基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并双向测序。从GenBank数据库中下载26种菊科植物的rDNA序列(包含完整的ITS2区域)。上述序列经过CodonCode Aligner v.9.0.1软件拼接后,用MEGA 11.0.10软件构建NJ系统聚类树,用TaxonGap v.2.4.1软件分析种内和种间变异。结果 采用系统聚类树法和遗传距离比较法,ITS2序列可以从3种蒿属植物中鉴别出大籽蒿(Artemisia sieversiana),6种紫菀属植物中鉴别出灰枝紫菀(Aster poliothamnus),2种垂头菊属植物中鉴别出车前状垂头菊(Cremanthodium ellisii)和条叶垂头菊(Cremanthodium lineare),3种风毛菊属植物中鉴别出美丽风毛菊(Saussurea superba),并且可以将小苦荬属的中华小苦荬(Ixeridium chinense)和窄叶小苦荬(Ixeridium gramineum)区分开,可以将毛香火绒草(Leontopodium stracheyi)、三角叶蟹甲草(Parasenecio deltophyllus)与其他物种区分开。ITS2序列可以成功地从26个菊科物种中鉴别出9个物种,鉴定效率为34.6%。结论 ITS2序列可以用于快速、准确地识别和鉴定部分菊科藏药材。     

6种红树林植物的ITS2条码鉴定

摘要：目的 研究红树林植物红树、拉关木、秋茄树、海桑、玉蕊、阔苞菊的ITS2（DNA内转录间隔区2,internal transcribed spacer 2）条码鉴定方法,为红树植物药用价值的开发和优良种质资源的引进提供鉴定基础。方法 对样本进行DNA提取、PCR扩增和双向测序。用CodonCode Aligner软件进行序列拼接,通过MEGA5.1软件比较各序列间的变异性,计算遗传距离;采用邻接法构建NJ(近邻结合法,Neighbor-Joining)系统树及采用ITS2 数据库模拟各植物的二级结构。结果 6种红树林植物的ITS2序列间存在明显变异,这种差异不仅体现在序列的碱基种类和数量上,更体现在ITS2序列遗传变异和二级结构上。结论 ITS2序列可准确有效地鉴别不同红树植物。     

基于DNA条形码序列分析的5种菖蒲属药用植物鉴定

目的构建菖蒲属药用植物的鉴别方法。方法采用DNA条形码序列技术,对5种菖蒲属药用植物的4条候选DNA条形码序列(ITS2、rbc L、mat K、psb A-trn H)进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,对比分析种内、种间的遗传变异、分析barcoding Gap并构建聚类分析树。结果 4条候选DNA条形码序列PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对菖蒲属药用植物的鉴定成功率最高。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术可以鉴定菖蒲属药用植物。     

基于ITS序列分析技术鉴定川牛膝与常见伪品麻牛膝

目的:比较川牛膝与其常见伪品麻牛膝之间的ITS序列差异及规律。为川牛膝与麻牛膝的DNA条形码鉴别提供适合的分子标记。方法:收集川牛膝及麻牛膝成品药材并提取纯化其基因组DNA,经PCR扩增得到ITS序列(包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2)并进行T-A克隆后测序,分析两者序列差异。结果:PCR扩增获得两者ITS序列,经多序列对比分析得出川牛膝与伪品麻牛膝的ITS序列存在明显差异。结论:ITS序列分析可以用作鉴定川牛膝与麻牛膝药材。     

蒙药悬钩子木的rbcL序列分析

目的 通过对蒙药悬钩子木DNA进行PCR扩增,测序分析不同产地悬钩子木的rbcL序列,并与悬钩子木混伪品的rbcL序列进行比较。方法 采用植物基因组DNA提取试剂盒,从悬钩子木20个样本中提取总DNA,对rbcL序列进行PCR扩增并测序;从GenBank上下载悬钩子木常见混伪品的rbcL序列,鉴定不同产地悬钩子木及其混伪品的rbcL序列。结果 悬钩子木的种内最大遗传距离小于混伪品的种间最小遗传距离,NJ系统发育树显示：悬钩子木20个样品聚为一支,能与同属的混伪品红泡刺藤、紫色悬钩子、拟复盆子、直立悬钩子、藏南悬钩子、多腺悬钩子、秀丽莓、无腺白叶莓、粉枝莓进行区分。结论 rbcL序列可用于鉴定悬钩子木及其混伪品的条形码序列。     

通关藤及其常见混伪品的ITS2条形码鉴别研究

目的:采用ITS2序列分析,对通关藤及其混淆品进行鉴别,确保用药安全。方法:从GenBank下载通关藤序列,使用MEGA5.0软件对测序序列及下载序列进行对比分析,统计变异位点、计算遗传距离、构建样品NJ树,运用NCBI Blast进行物种鉴定,并与性状鉴别结果进行核对。结果:ITS2序列分析与遗传距离计算结果显示各通关藤样品间有明显差异,NJ树聚类结果能明显区分通关藤正品与伪品。结论:ITS2可准确鉴别通关藤及其伪品,可用于中药材真伪的快速鉴别,应用前景广阔。     

白术和苍术的鉴定研究

目的探讨白术和苍术的鉴定。方法本研究采用ITS2序列对药材白术与苍术进行DNA条形码鉴定。结果白术与苍术的3个基原物种(苍术、关苍术和朝鲜苍术)ITS2序列均为229 bp。13条白术的序列仅在98 bp处有C-G变异,平均CG含量为69.42%;3条苍术序列无变异位点;关苍术与朝鲜苍术的种内最大K2P距离均为0.013。白术、朝鲜苍术序列能各自聚为一支,关苍术与苍术聚为一支。结论 ITS2序列在药材白术与苍术鉴定方具有很好的鉴别效果。