IFN-α磷酸化STAT1和STAT4诱导人NK细胞产生IFN-γ并增强其杀伤活性

目的研究IFN-α对CD56+NK细胞的细胞因子分泌、杀伤功能和细胞内信号传导的作用。方法分离健康人PBMC分别与培养液、IFN-α和IL-12培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析IFN-α诱导IFN-γ产生的细胞亚群以及该细胞亚群对肿瘤细胞的杀伤作用和信号传导机制。结果经IFN-α刺激后,PBMC能产生低剂量的IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,IFN-α诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。IFN-α促进NK细胞的杀伤功能。促进STAT1和STAT4磷酸化。结论 IFN-α通过磷酸化STAT1和STAT4,增加NK细胞IFN-γ分泌和增强杀伤功能。     

乙型肝炎病毒导致慢性乙型肝炎患者血中CD56dimNK细胞亚群数量下降

目的观察乙型肝炎病毒对慢性乙型肝炎患者NK细胞亚群的影响。方法利用流式细胞术检测20例正常人及62例慢性乙型肝炎患者人外周血淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD56、CD16的表达;同时观察NK细胞亚群改变与乙型肝炎病毒携带量的相关性。结果①人类NK细胞根据CD56分子的表面密度可分为两个截然不同的群体,绝大多数（约90％）的NK细胞低水平表达CD56（CD56^dim）且高表达CD16,少数NK细胞（10％）高水平表达CD56（CD56^bright）且缺乏或低水平表达CD16;②慢性乙型肝炎患者CD56^brightNK细胞的表达及绝对数量较正常对照组无明显的改变,CD3^-CD56^＋、CD3^-CD56^dimNK细胞的绝对数量较正常对照组显著减少（P〈0．05）;③慢性乙型肝炎患者NK细胞亚群改变与患者的病毒携带量无关;④慢性乙型肝炎患者CD3^＋、CD3^＋CD4^＋比例及绝对数量较正常对照组显著减少（P〈0．05）。结论机体感染乙型肝炎病毒后,导致CD56^dim增殖的关键因子IL-2、IL-21活性下降,使CD56^dim数量选择性减少,减弱NK细胞介导机体ADCC的功能。     

探讨乙肝患者外周血淋巴细胞的表达

淋巴细胞不同亚群对病毒抗原的应答反应不同,对乙型肝炎的进展的影响也不同。本文采用流式细胞技术（FACS）,对乙型肝炎患者外周血CD3＋T细胞、CD4＋T细胞、CD8＋T细胞、CD16＋CD56＋（NK细胞）、CD19＋（B细胞）进行检测。并探讨HBV感染后乙型肝炎患者的细胞免疫状态与疾病发展的关系。     

CD49a阳性NK细胞参与类风湿关节炎疾病进程

目的 研究外周血中CD49a阳性NK细胞的功能及其在类风湿关节炎中的作用。方法 流式细胞术检测健康志愿者和类风湿关节炎患者外周血NK细胞及其亚群包括CD56brightNK、CD56dimNK细胞群上CD49a及IFN-γ的表达;ELISA检测健康志愿者和类风湿关节炎患者血浆中IFN-γ的表达。结果 与健康志愿者相比,RA患者外周血NK细胞及其2个亚群上CD49a的表达均显著升高。在RA患者血浆、外周血NK细胞及其亚群上IFN-γ的表达显著升高;同时CD49a与IFN-γ双阳性的NK细胞比例增加,且CD49a阳性NK细胞较CD49a阴性NK细胞表达更高水平的IFN-γ。结论 CD49a阳性NK细胞参与类风湿关节炎疾病进程。     

活动期结核病患者外周血NK细胞免疫反应特征分析

为了探讨自然杀伤(nature killer,NK)细胞在抗结核免疫应答中的特征,我们表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT-6,体外刺激结核病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC),采用流式细胞术分析不同亚群NK细胞IFN-γ释放,并与T细胞释放IFN-γ水平进行相关性分析。结果显示,经结核特异性抗原ESAT-6刺激后,结核患者来源的PBMC中有2.80%±0.65%的NK细胞可以释放IFN-γ,而正常人NK细胞释放的比例仅为0.09%±0.01%,两者间有显著差异(P0.001);同时CD56highCD16dim NK亚群细胞分泌IFN-γ的水平(6.50%±0.94%)显著高于CD56dimCD16high NK亚群细胞(1.78%±0.38%);比较同一抗原刺激条件下T细胞释放IFN-γ的能力,显示NK细胞释放IFN-γ的能力高于CD4+T和CD8+T细胞,并与释放IFN-γ的CD4+T细胞的比例呈显著正相关。上述研究结果表明,NK细胞在结核特异性抗原ESAT-6刺激下可通过分泌高水平的IFN-γ协同CD4+T细胞在抗结核感染中发挥重要作用,增强NK细胞的功能,以提高结核病患者的免疫应答水平,将为结核病的治疗提供新的策略。     

乙型肝炎患者外周血细胞中Th1/Th2型细胞因子的表达及其临床意义

目的 :探讨Th1 Th2型细胞因子在HBV感染的临床多种表现形式中的表达特征及其临床意义。方法 :采用四色法流式细胞术检测乙型肝炎患者和正常人外周血细胞中CD3+CD8+、CD3+CD8-细胞内的IFN γ和IL 4的表达情况。结果 :与正常对照组相比 ,急性乙肝患者的Tc2细胞百分比增高 ,慢性乙肝患者的Th1、Tc1细胞百分比减低 ,也低于急性乙肝患者 ,但Th1、Tc1细胞百分比随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而逐渐增多。分泌IL 4的Th、Tc细胞在正常人和各组病例中无显著性差异。结论 :急慢性乙肝患者的Th、Tc细胞均以分泌Th1型细胞因子占优势 ,但数量的差异可能是HBV感染者不同结局的原因之一。     

慢性乙型肝炎患者外周血NKG2A+NK 细胞与Treg 的关系研究

目的:探讨慢性乙型肝炎病毒(CHB)患者外周血NKG2A+NK 细胞与调节性T 细胞(Treg)的关系及临床意义。方法:收集46 例CHB 患者和17 例健康对照者外周血,采用实时荧光定量PCR 法检测血清HBV DNA;采用流式细胞术检测NKG2A+NK 细胞及Treg 的比例。结果:将CHB 患者分为Low HBV DNA 组(300 ~ 104 U/ ml)及High HBV DNA 组(105 ~108 U/ ml)。我们发现High HBV DNA 组ALT 明显高于Low HBV DNA 组(P<0.05)。High HBV DNA 组CD56dim NK 细胞及NKG2A+CD56dim NK 细胞的比例均分别明显高于Low HBV DNA 组(P<0.05)。且High HBV DNA 组Treg 明显高于Low HBVDNA 组和对照组(P<0.05)。此外,NKG2A+CD56dim NK 细胞的比例与High HBV DNA 载量及Treg 水平均呈正相关性(r =0.59,P<0.05;r =0.53,P<0.05)。结论:CHB 患者的NKG2A+CD56dim NK 细胞的水平与HBV 的免疫逃逸及疾病的进展相关。     

不同亚群CD8＋T细胞细胞毒作用对慢性乙型肝炎的影响

目的观察慢性乙型肝炎不同分期及干扰素-a（interferon-a,IFN-a）治疗前后外周血不同亚群CD8＋T细胞细胞毒作用的变化,探讨其在慢性乙型肝炎发病机理及抗病毒治疗中的作用。方法采集20例慢乙肝免疫耐受期患者和20例免疫清除期患者IFN—a治疗前后的外周全血,采用流式细胞仪检测CD8^high和CD8^lowT细胞的颗粒酶B（Granzyme B,GrB）和溶酶体相关膜蛋白-1（Lysosome—associated membrane protein．1,LAMP-1,CD107a）表达变化,并进行分析。结果（1）慢乙肝患者免疫清除期不同亚群CD8＋T细胞GrB和CD107a的表达水平均高于免疫耐受期;（2）不同分期慢乙肝患者CD8^lowT细胞GrB和CD107a的表达水平均高于CD8^highT细胞;（3）IFN—a治疗后CD8^highT细胞的GrB和CD107a表达水平和治疗前相比具有升高趋势,而CD8^lowT细胞反而具有下降趋势;（4）不同亚群CD8＋T细胞的GrB和CD107a表达水平与HBV—DNA载量在免疫耐受期呈正相关,而在免疫清除期呈负相关。结论（1）不同亚群CD8＋T细胞的GrB和CD107a分子在慢乙肝疾病进程及抗病毒治疗中均起重要作用,CD8^lowT细胞的细胞毒作用强于CD8^highT细胞,而CD8^highT细胞的细胞毒效应在IFN—a治疗过程中逐渐增强。（2）不同亚群CD8＋T细胞的GrB和CD107a分子水平与HBV病毒载量的相关性在一定程度上可以提示机体免疫应答与病毒之间的关系。     

自然流产患者外周血与蜕膜NK细胞亚群数量变化的研究

目的：研究自然流产患者外周血与蜕膜组织自然杀伤细胞亚群数量的变化。方法：对36例自然流产患者及30例正常健康早孕者（对照）外周血及蜕膜组织中淋巴细胞进行单克隆抗体标记,应用流式细胞仪定性、定量分析技术对NK细胞（natural killer)亚群进行分析。结果：（1）流产组外周血及蜕膜组织NK细胞CD56＋CD16＋百分比较对照组明显升高。（P＜0．01）,而蜕膜组织中NK细胞CD56＋CD16－百分比明显低于对照组（P＜0．001）。（2）外周血与蜕膜组织NK细胞CD56＋CD16＋亚群存在相关性（γ＝0．516,P＜0．05）。结论：NK细胞亚群的数量变化可以引起蜕膜免疫微环境的失调,导致自然流产。外周血与蜕膜NK细胞CD56＋CD16＋亚群存在正相关关系。     

乙型肝炎患者免疫功能的检测及其临床意义

研究乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞和血清免疫球蛋白的变化及临床意义.采用流式细胞仪检测150例乙肝患者和30名健康者(对照组)外周血T淋巴细胞亚群(CD3 CD4 、CD3 CD8 )、NK细胞,免疫散射法检测血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)变化.结果表明各临床类型乙肝患者NK细胞降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);慢性乙型肝炎组、慢性重型乙型肝炎组、肝硬化组外周血CD3 CD4 、CD3 CD8 T细胞均下降,其中慢性重型乙型肝炎组外周血CD3 CD8 与对照组比较有显著性差异(P<0.01),急性乙型肝炎组外周血T细胞亚群变化不明显(P>0.05);各临床类型乙型肝炎患者血清免疫球蛋白IgG、IgA随着病情的进展逐渐升高,与对照组比较有显著性差异(P<0.01).因此认为慢性乙肝患者存在细胞免疫和体液免疫功能紊乱,免疫功能的检测对乙肝的诊断、治疗及预后的判断有着一定临床意义.     

乙型肝炎患者外周血细胞中Thl／Th2型细胞因子的表达及其临床意义

目的：探讨Thl／Th2型细胞因子在HBV感染的临床多种表现形式中的表达特征及其临床意义。方法：采用四色法流式细胞术检测乙型肝炎患者和正常人外周血细胞中CD3 CD8 、CD3 CD8-细胞内的IFN-γ和IL-4的表达情况。结果：与正常对照组相比，急性乙肝患者的Tc2细胞百分比增高，慢性乙肝患者的Thl、Tcl细胞百分比减低，也低于急性乙肝患者，但Thl、Tcl细胞百分比随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而逐渐增多。分泌IL-4的Th、Tc细胞在正常人和各组病例中无显著性差异。结论：急慢性乙肝患者的Th、Tc细胞均以分泌Th1型细胞因子占优势，但数量的差异可能是HBV感染者不同结局的原因之一。     

新生儿细菌性肺炎患者外周血自然杀伤细胞的数量变化及其临床意义

目的检测新生儿细菌性肺炎患者外周血总自然杀伤细胞(NK细胞)及其各亚群百分率的变化,探讨NK细胞在其发病中的临床意义。方法采用流式细胞术检测38例新生儿细菌性肺炎患者及18例正常新生儿的总NK细胞及其各亚群占外周血总淋巴细胞百分率,住院天数在10 d以内(含10 d)为A组、住院天数10 d以上为B组;入院时外周血白细胞的数量5.0×109/L或20.0×109/L者为重度感染组,5.0×109/L外周血白细胞数量20.0×109/L者为轻度感染组。结果新生儿细菌性肺炎患者外周血总NK细胞及CD3-CD56negCD16bright百分率低于正常新生儿(P0.01),但NK细胞CD3-CD56bright CD16neg/dim及CD3-CD56dimCD16bright亚群差异无统计学意义。A组CD3-CD56negCD16bright亚群百分率低于正常新生儿(P0.01),而总NK细胞及其他亚群则差异无统计学意义。B组总NK细胞及CD3-CD56negCD16bright亚群百分率低于正常新生儿(P0.01),且B组总NK细胞及各亚群百分率低于A组(P0.05)。重度感染组总NK细胞及其各亚群百分率明显低于轻度感染组,差异有统计学意义(P0.05)。结论新生儿细菌性肺炎患者病情越重住院时间越长,总NK细胞及其各亚群百分率越低。     

不同类型HBV感染者外周血Treg/Th17细胞的变化及意义

目的:探讨不同类型HBV感染者外周血中CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞的变化及意义.方法:选取15例急性乙型肝炎(Acute Hepatitis B,AHB)患者、40例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者、40例无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers,AsC)及30例健康对照者,分别采用流式细胞术、RT-PCR和ELISA检测外周血CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞百分率、核转录因子foxhead winged-helix box protein 3 (Foxp3)/retinoid-related orphan receptor gamma-t (RORγt) mRNA的表达以及血浆转化生长因子-β1(Transforming growth factor-31,TGF-β1)/IL-17的水平.结果:AHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA及TGF-β1水平与正常对照组相比无明显差异(P＞0.05);而CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγtmRNA及IL-17水平与正常对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).CHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA、TGF-31水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平与正常对照组相比均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常对照组相比,AsC组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mR-NA、TGF-β1水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平无明显差异(P＞0.05).结论:在不同类型HBV感染者外周血中Treg/Th17细胞失衡,Treg/Th17细胞可能与HBV感染的状态有关.     

乙肝病毒感染不同阶段抗原肽特异性细胞毒性T 淋巴细胞的初步研究

目的:为了阐明HBV 感染不同阶段机体免疫功能的不同。方法:分别构建了我国最高频等位基因HLA鄄A*0201 三种常见抗原肽表位(HBVcore18-27、pol575-583、env335-343)四聚体复合物,并用这些四聚体检测HBV 感染外周血单个核细胞(PBMCs)中HLA-A*0201 限制性抗原特异性CD8+ T 细胞的频率、功能及CD127 的表达。结果:在大多数自限性HBV感染者的PBMCs 中抗原特异性CD8+ T 细胞的频率和增殖能力都高于慢性HBV 感染者。在低病毒载量的免疫低复制期抗原特异性CD8+ T 的数量和在高病毒载量、肝脏损害免疫清除期及免疫耐受期抗原特异性CD8+ T 细胞频率是相似的,同病毒定量及ALT 水平无显著相关性。慢性HBV 感染者抗原特异性CD8+ T 细胞增殖能力和病毒滴度呈反比。在自限性HBV 感染患者抗原特异性CD8+ T 细胞分泌IFN 的功能明显高于慢性HBV 患者,在免疫耐受期基本丧失产生细胞因子的能力;HBV 感染后不同免疫状态的HBsAg 水平不同,免疫耐受期最高,其次为免疫清除期、再活动期,低复制期的最低。而且随着HBsAg 水平下降,同HBV DNA 的相关性也逐渐下降。慢性HBV 感染者中CD8+ CD127+ T 细胞要低于对照组及自限性感染组,特别是在HBeAg 阳性的免疫耐受期及免疫清除期组患者中CD8+ CD127+ T 细胞比例更低。结论:慢性HBV 感染中抗原特异性CD8+ T细胞的频率不是决定免疫应答的唯一因素,慢性乙肝患者体内记忆性的抗原特异性CD8+ T 细胞并未被完全清除或缺失,这为治疗性疫苗和免疫恢复治疗提供了可行性。     

慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T细胞γ干扰素和白细胞介素4的水平变化

目的研究慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染过程中外周血T细胞表达细胞因子的调节作用。方法 60例慢性HBV感染者分为免疫耐受期组、免疫清除期组和非活动期组,20例健康人群作为对照组。另收集21例乙型肝炎病毒e抗原(HBe Ag)阳性的慢性乙型肝炎患者,进行恩替卡韦治疗6个月。全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,PCR法检测HBV DNA载量,流式细胞术检测T细胞γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平。结果慢性HBV感染者的外周血CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的IFN-γ水平与HBV DNA载量呈反比,IFN-γ/IL-4比率与HBV DNA载量和血清ALT水平均呈反比。此外,从免疫耐受期到非活动病毒携带期,T细胞的IFN-γ水平逐渐增加、IL-4水平逐渐降低,且与对照组相比,免疫耐受期患者的T细胞表达IL-4增加且IFN-γ减少,到非活动携带期其细胞因子表达逐渐恢复。慢性乙型肝炎患者经恩替卡韦抗病毒治疗后,血清HBV DNA载量和ALT水平均明显降低,同时其外周血CD8~+T细胞的IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比率均明显增加。结论慢性HBV感染过程中,外周血T细胞的IFN-γ和IL-4发挥双向调节作用,与恩替卡韦抗病毒疗效相关。     

Th9细胞在慢性乙型肝炎病毒感染不同阶段中的作用

目的观察不同阶段的慢性乙型肝炎病毒感染者外周血Th9细胞频数及其功能分子IL-9的表达,并探讨其免疫学意义。方法选取处于免疫耐受期的无症状性HBV携带者(AsC)8例、处于免疫清除期的慢性乙型肝炎患者(CHB)28例、处于低(非)复制期的非活动性HBsAg携带者(IHC)16例以及健康人12例,分别作为AsC组、CHB组、IHC组和HC组。用流式细胞仪检测各组外周血Th9细胞,酶联免疫吸附试验检测血清IL-9水平,分析Th9细胞频数与临床指标如ALT、AST、TBil、DBil以及HBV DNA的相关性。结果 AsC组和CHB组外周血Th9细胞频数、IL-9水平较健康对照组明显升高(P0.05);IHC组和健康对照组之间外周血Th9细胞频数、IL-9水平差异无统计学意义(P0.05);AsC组和CHB组之间Th9细胞频数、IL-9水平差异无统计学意义(P0.05)。AsC组和CHB组Th9细胞频数与HBV DNA水平呈正相关(r=0.435,P=0.008);CHB组Th9细胞频数与ALT、AST、TBil、DBil水平无相关性。结论在慢性HBV感染的免疫耐受期和免疫清除期Th9细胞与HBV持续性感染及高复制状态有关,与免疫清除期内免疫介导的肝组织病理损伤无明确相关性。     

金黄色葡萄球菌脂磷壁酸纯化及其抗肿瘤的初步研究

目的从金黄色葡萄球菌细胞壁中提取脂磷壁酸(LTA),研究其抗肿瘤活性。方法冷酚法提取LTA,经SepharoseCL4B纯化,检测LTA毒性;观察荷瘤小鼠注射LTA后的生命延长率及抑瘤率,NK细胞活性,TNFα、IFNγ分泌。结果LTA未见明显毒性,能提高荷瘤小鼠生命延长率;明显抑制实体瘤生长;提高NK细胞活性;诱导分泌多量TNFα及IFNγ。结论LTA可通过提高NK细胞活性,诱导分泌多量TNFα及IFNγ等细胞因子发挥抗肿瘤活性。     

慢性 HCV 感染者外周血中 CD56＋T 细胞频数、表型和体外细胞毒功能研究

目的探讨慢性HCV感染者外周血中CD56＋T细胞的频数、表型和体外细胞毒功能特征。方法采用流式细胞术检测33例慢性HCV感染者及21例健康对照者外周血CD56＋T细胞的频数和细胞表面活化性受体NKG2C、CD16、NKp46和抑制性受体CD158a、NKG2A的表达水平;检测体外未刺激及K562细胞刺激作用下CD 56＋T细胞毒效应（ CD107a）和细胞因子分泌水平（ IFN-γ和TNF-α）,并分析上述3种CD56＋T细胞功能指标之间的关联性。结果与健康对照相比,慢性HCV感染者外周血中CD56＋T细胞在淋巴细胞中的比例明显降低（ P＝00．18）。 CD56＋T细胞表面的活化性受体 NKG2C（P＝0．015）、CD16（P＝0．036）、NKp46（P＝0．001）均有不同程度降低,而抑制性受体CD158a、NKG2A未发现有统计学意义的差异（P＞0．05）。体外未刺激情况下,慢性HCV感染者CD56＋T细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF -α均显著弱于健康对照组（P ＜0．0001）;在K562细胞刺激作用下,慢性HCV感染者 CD56＋T细胞CD107 a水平及分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α均呈显著降低趋势（ P＜0．0001）,且3种功能指标表达水平密切关联（r＞0．80, P＜0．0001）。结论慢性HCV感染者CD56＋T 细胞频数降低,细胞毒能力和重要细胞因子分泌能力均明显减弱。该结果提示显著受损的CD56＋T细胞功能可能与HCV慢性持续性感染有关。     

HBV转基因小鼠脾脏DC的TLR2、TLR9和T细胞Elispot检测分析

目的:进一步研究HBV转基因小鼠免疫状态。方法:应用流式细胞仪和Elispot方法分别对转基因鼠脾脏树突状细胞(DC)的Toll样受体TLR2、TLR9和分泌γ干扰素T细胞功能进行检测。结果:与正常同种鼠比较,HBV转基因小鼠脾树突状细胞表达CD11c及TLR2、TLR9无明显差异,但分泌IFN γ的T细胞对HBsAg特异性刺激产生的斑点数存在显著差异(P<0 0 5 )。结论:提示HBV转基因小鼠的先天和后天免疫状态是正常的,仅对乙型肝炎病毒存在特异性免疫耐受