合成人降钙素基因实验研究的初步报告

目的 :合成含人胰岛素分泌信号的人降钙素基因。方法 :将人胰岛素分泌信号和人降钙素基因的序列分成六个片断合成单链寡核苷酸作为PCR的引物和cDNA合成的模板。应用动态模板PCR反应直接扩增出人胰岛素和降钙素的编码序列。结果 :经含EB的 1.5 %琼脂糖凝胶电泳 ,证明合成的基因含编码人胰岛素分泌信号和人降钙素的全长DNA序列。结论 :本研究为基因合成提供了一种新的可靠方法。     

降钙素基因相关肽在人淋巴结中表达的研究

目的;通过对降钙素基因相关肽在淋巴结中表达的研究,探讨淋巴结的神经免疫内分泌功能。方法：运用 免疫组织化学ＳＡＢＣ法,对人正常淋巴结35例进行标记。结果 人正常淋巴结表达明显阳性,主要在副皮质区、生发中心及巨噬细胞等部位表达。结论：降钙素基因相关肽可能在淋巴结中合成,淋巴结除了具有免疫功能外,还具有明显的神经内分泌功能,降钙素基因相关肽是神经内分泌免疫网络中共同的生物学语言。     

connexin43基因体外转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的研究

目的将含有connexin43基因的质粒在脂质体的介导下转染进入大鼠L6骨骼肌成肌细胞,使用G418根据有限稀释法筛选单克隆细胞株L6 myoblast-Cx43。方法通过免疫细胞化学技术、Western blot技术,对整合有connexin43基因的阳性细胞克隆进行检测。结果两个阳性克隆组Cx43蛋白表达均明显高于对照组。结论获得的两个持续高表达connexin43蛋白的细胞株可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。     

人成肌细胞体外培养的动态观察和形态学的初步研究

以肌组织原代培养方法对正常人成肌细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜观察成肌细胞的成肌过程，并应用透射和扫描电镜以及免疫细胞化学技术研究成肌细胞的超微结构以及中间丝结蛋白的分布情况。结果显示，体外培养肌细胞可分为缓慢生长、分裂增殖和肌管形成期3个不同的生长、成熟阶段。成肌细胞是幼稚的早期单核肌细胞，体外分裂增殖能力强，可呈克隆生长或(和)簇状分布的不断的成熟分化过程。分裂增殖期成肌细胞胞浆有束状平行排列的肌丝以及线粒体和糖原分布，并呈逐步的分化成熟过程，可相互融合形成肌管，并可与韧生肌管进一步融合发育成熟。各期成肌细胞胞浆中间丝结蛋白呈阳性反应，早期生成结蛋白量少且分布不均。上述方法对同期培养的成肌细胞与纤维母细胞可资鉴别。     

人成肌细胞体外培养的动态观察和形态学的初步研究

以肌组织原代培养方法对正常人成肌细胞进行体外培养；用倒置相差显微镜观察成肌细胞的成肌过程，并应用透射和扫描电镜以及免疫细胞化学技术研究成肌细胞的超微结构以及中间丝结蛋白的分布情况。结果显示，体外培养肌细胞可分为缓慢生长、分裂增殖和肌管形成期３个不同的生长、成熟阶段。成肌细胞是幼稚的早期单核肌细胞，体外分裂增殖能力强，可呈克隆生长或（和）簇状分布的不断的成熟分化过程。分裂增殖期成肌细胞胞浆有束状平行排列的肌丝以及线粒体和糖原分布，并呈逐步的分化成熟过程，可相互融合形成肌管，并可与初生肌管进一步融合发育成熟。各期成肌细胞胞浆中间丝结蛋白呈阳性反应，早期生成结蛋白量少且分布不均。上述方法对同期培养的成肌细胞与纤维母细胞可资鉴别。     

人成肌细胞向神经前体细胞转分化及在大鼠体内移植的研究

目的探讨成人成肌细胞能否转分化为神经前体细胞。方法从6例成人正常颞肌标本中分离培养成肌细胞,培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液,诱导2周,对诱导细胞进行免疫细胞化学鉴定和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析;将诱导细胞和人成肌细胞分别移植到12只脑缺血大鼠脑内,采用免疫组织化学植细胞的存活和分化进行鉴定。结果成肌细胞在经诱导7 d 后开始聚集成球,悬浮生长,该细胞球平均每14 d 传代1次。细胞球均表达巢蛋白,在分化条件下,(36±6)%的细胞表达微管相关蛋白2,(44±5)%的细胞表达胶质纤维酸性蛋白,(17±4)%的细胞表达半乳糖脑苷脂;经诱导细胞移植到大鼠脑内后表达微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白。而对照组的成肌细胞则不表达上述标志物。结论人成肌细胞在体外一定诱导条件下能够转分化为神经前体细胞。     

微囊化对转VEGF基因成肌细胞血管内皮生长因子分泌的实验研究

目的观察微囊化过程对转VEGF基因成肌细胞分泌VEGF蛋白的影响,从而为微囊化细胞应用于促进缺血皮瓣动物模型皮瓣成活的实验研究做准备。方法将成长旺盛的转VEGF基因成肌细胞分别进行微囊化及非微囊化。14 d内定期对培养液定量提取,检测VEGF蛋白浓度,进行统计学分析。结果检测结果证实,微囊化及非微囊化后无明显差别,两者VEGF浓度均在1～4 d上升,在第5 d接近峰值,7 d后浓度缓慢下降。结论微囊化与否对转VEGF基因成肌细胞分泌VEGF蛋白过程没有显著影响。     

MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的实验研究

目的：探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法：将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞，观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化；用RT-PCR和Western blot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果：MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化；RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD；Western blot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素；免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论：MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞，为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。     

软骨源性形态发生蛋白2基因转染自体成肌细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的研究软骨形态发生蛋白-2(CDMP-2)对小鼠成肌细胞向软骨分化的作用。方法体外培养小鼠成肌细胞,贴壁细胞传代,取第3代细胞,对照组(A组)以无血清L-DMEM培养液培养,实验组(B、C、D组)以无血清L-DMEM培养液培养,分别加入透明质酸钠、CDMP-2(100ng/mL)和CDMP-2基因转染的小鼠成肌细胞,14d后终止培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色糖胺聚糖(GAG),行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、灰度值分析和Western blot检测。结果培养14d后转染组和诱导组可见成肌细胞形态由梭形向软骨细胞的多边形转变。甲苯胺蓝染色示糖胺聚糖(GAGs)均匀分布于基质中,免疫组织化学染色和Western blot示实验组Ⅱ型胶原表达阳性,且CDMP-2基因转染组细胞表达Ⅱ型胶原水平高于单独给予CDMP-2,且具有统计学意义;对照组和透明质酸钠组未见阳性表达。结论 CDMP-2基因转染的小鼠成肌细胞能够更好的表达软骨特异性Ⅱ型胶原。     

转染VEGF165基因的自体成肌细胞治疗心肌梗死的实验研究

目的:将体外培养、纯化并转染VEGF165基因的新西兰兔自体骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死区,观测转染VEGF165基因的成肌细胞移植对改善梗死区心肌血运重建和心功能的影响。方法:采用pcDNA3.1-VEGF165和pcDNA3.1质粒转染经体外培养及纯化的新西兰兔自体骨骼肌成肌细胞。结扎兔冠状动脉致局部心肌梗死后2周,分别于心肌梗死区移植转染VEGF165基因成肌细胞(实验组,n=8)和空载体成肌细胞(对照组,n=8),4周后观察心肌梗死边缘区毛细血管密度、植入细胞的形态鉴定和心功能改善情况。结果:成功将pcDNA3.1-VEGF165和pcDNA3.1质粒转染体外培养的兔自体骨骼肌成肌细胞,成肌细胞移植后能在梗死区种植成活、分化。实验组细胞移植区域的毛细血管密度较对照组高(P<0.05)。经Buxco系统有创心功能测定显示:实验组较对照组的左心室等容收缩期室内压最大上升速率[+dp/dtmax,(1607.23±102.67)mmHg/s vs(1217.77±89.91)mmHg/s]和左心室等容舒张期室内压最大下降速率[-dp/dtmax,(1535.09±81.34)mmHg/s vs(1174.58±91.50)mmHg/s]均有所改善。结论:转染VEGF165的成肌细胞能改善心肌梗死区域的血液供应,增加心肌收缩力,改善心功能。     

成肌细胞移植治疗DMD模型-mdx鼠骨骼肌Dystrophin表达的实验研究

目的探讨成肌细胞移植(MTT)治疗Duchenne型肌营养不良症模型-mdx鼠的可能性。方法运用体外分离培养6d处在分裂增殖期的成肌细胞,经过纯化并以FG荧光标记后进行肌肉注射于Duchenne型模型鼠-mdx鼠。移植后1月、2月、3月分别取实验鼠的四肢骨骼肌,运用免疫荧光法检测抗肌萎缩蛋白的表达情况。结果成肌细胞移植后1,2,3月后mdx鼠的抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维增加。结论成肌细胞肌肉注射移植能够在一定程度上修复mdx鼠的萎缩肌肉组织。     

降钙素受体在骨转移瘤中的表达水平及意义

目的：通过检测CTR在18例骨转移瘤中的表达情况,初步探讨CTR与骨转移瘤之间的关系。方法：选取骨转移瘤患者18例,根据X线表现成骨表现组4例与溶骨表现组14例。应用免疫组织化学染色法检测CTR表达,并作出统计学分析。结果：18例骨转移瘤患者中,CTR阳性表达15例,阳性率为83.0%;10例正常骨组织中,CTR阳性表达3例,阳性率为30.0%,二者之间有非常显著性差异（P〈0.01）。成骨表现组6例,CTR阳性表达3例,阳性率为50.0%;溶骨表现组19例,CTR阳性表达18例,阳性率为92.8%,二者之间有显著性差异（P〈0.05）。结论：CTR在骨转移瘤中的表达水平高于正常骨组织,而且在溶骨型骨转移瘤中的表达水平高于成骨型骨转移瘤。     

Cbfa1因子对成纤维细胞中软骨相关基因表达的影响

目的研究转录因子Cbfa1在软骨发生中的作用。方法应用逆转录聚合酶链反应酶技术,直接从E13．5d胎鼠肢芽细胞中克隆出Cbfa1全长cDNA,并将其定向克隆到13cDNA3．1质粒载体中,经酶切鉴定和序列分析证实了克隆的正确性。在构建出Cbfa1真核表达载体后,将其转化到成纤维细胞中,48h后比较转染组和未转染组Sox9、Sox5和Sox6基因的转录表达情况,72h后比较转染组和未转染组中Ⅱ型胶原的表达。结果Cbfa1在成纤维细胞中的高表达能提高Sox9和Ⅱ型胶原的表达,但Cbfa1在成纤维细胞中的高表达对Sox5和Sox6的表达没有影响。结论Cbfa1可能参与了软骨细胞的发育调控。     

GR6基因的结构特征以及在结直肠肿瘤中的表达

目的:了解GR6基因及其蛋白质产物GR6假设蛋白的结构特征,以及GR6基因在结直肠肿瘤中的表达改变.方法:采用生物信息学的软件和数据库,分析GR6基因的结构特点及其蛋白质产物GR6假设蛋白的二级结构特征和功能特点等,并采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测39例结直肠癌组织和配对的远端切缘正常组织,以及19例癌旁组织和14例腺瘤组织中GR6的转录表达水平.结果:序列分析表明,GR6基因由3个外显子组成,含有4个CpG岛,编码产物为149个氨基酸组成的GR6假设蛋白.用生物信息学分析发现,GR6假设蛋白含有1个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点和3个N-肉豆蔻酸化位点及核定位信号,提示GR6基因的表达产物可能是细胞核内的一种信号分子.mRNA水平上,GR6的转录表达水平从正常-癌旁-腺瘤-腺癌逐步递减,其中,正常与腺瘤(P<0.05)、正常与腺癌(P<0.01)的表达差异具有显著意义.结论:GR6基因的表达产物即GR6假设蛋白可能是细胞核内的一种信号分子.GR6基因在结直肠肿瘤中低表达,在结直肠肿瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用.     

支气管扩张症肺组织内降钙素表达的临床意义

目的　了解支气管扩张症肺组织降钙素 (CT)蛋白表达水平与其病变特点的关系。方法　应用免疫组化方法定量分析 4 5例支气管扩张症患者手术切除的肺组织 ,对其气道上皮内神经内分泌细胞 (NEC)计数 ,并与 19例无肺部疾患的尸检肺组织进行比较。结果　 2组均可见被染成棕红色的CT阳性细胞 ,它们分布于肺内各级支气管上皮细胞间 ,以支气管分叉处较多见。支气管扩张症组肺组织内5 0 0 0个上皮细胞中CT阳性细胞数为 (6 7.4 8± 11.0 3)个 ,非支气管扩张症组肺组织内CT阳性细胞数仅为 (5 .0 2± 1.0 0 )个 ,2组比较有非常显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　支气管扩张症肺组织高水平CT表达可能与其慢性炎症改变有关 ,其局部CT表达增高可能系机体对支气管扩张病变的一种局部性代偿或调节机制。     

运动对糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖运载体基因表达的影响

目的研究运动对链脲佐菌素引起的糖尿病大鼠骨骼肌细胞内葡萄糖运载体４（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓ－ｐｏｒｔｅｒ，ＧＬＵＴ４）基因表达的作用。方法实验大鼠分为３组：（１）糖尿病非运动组；（２）糖尿病运动组；（３）正常对照组。每组６只大鼠。糖尿病运动组大鼠进行６周游泳训练。用斑点杂交法检测３组大鼠骨骼肌细胞内ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ含量。结果糖尿病大鼠骨骼肌细胞内ＧＬＵＴ４基因表达明显降低，ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ含量与正常对照组相比减少５４．９％。糖尿病运动组大鼠经过６周运动训练，血糖由１８．５±１．９ｍｍｏｌ／Ｌ降至１４．０±３．３ｍｍｏｌ／Ｌ（ｔ＝４．６４，Ｐ＜０．０１），骨骼肌细胞内ＧＬＵＴ４ｍＲＮＡ含量与糖尿病大鼠相比增加５６％（ｔ＝１５．５６，Ｐ＜０．０１）。结论在糖尿病高血糖状态下，大鼠骨骼肌细胞内的ＧＬＵＴ４基因表达受到抑制，这可能是胰岛素抵抗受体后缺陷的重要原因。运动训练能够促进糖尿病大鼠受抑的ＧＬＵＴ４基因表达的部分恢复，这可能是运动增加外周组织对胰岛素的敏感性，降低血糖的机制之一。     

新生C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的实验研究

目的建立C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离新生C57BL/6小鼠的成肌细胞,用Percoll分离液纯化细胞,在含15%胎牛血清的DMEM培养基中进行成肌细胞培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,Desmin抗体鉴定成肌细胞。结果经过Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离,Percoll纯化的成肌细胞纯度较高,Desmin染色95%以上的细胞胞浆染色阳性。结论采用Percoll纯化、国产胎牛血清培养,可以获得高纯度的成肌细胞。     

蓝藻抗病毒蛋白N全长基因原核表达克隆的构建

目的构建蓝藻抗病毒蛋白（CV-N）全长基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法根据GeneBank中CV-N的全基因序列,人工合成CV-N序列,进行PCR扩增。将扩增的PCR产物经双酶切后,克隆到原核表达载体pET30a（＋）上,构建重组表达载体pET30a—CV-N。重组质粒经核苷酸测序鉴定后,转化宿主茵BL21（DE3）诱导表达目的蛋白。结果CV-N基因可在大肠杆菌中高效表达,重组蛋白相对分子质量为11Kd,以包涵体形式存在。结论成功地构建了CV—N原核表达载体,为CV—N的纯化及其抗病毒的活性研究奠定了基础。