丙型肝炎病毒相关适配分子的研究进展

指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外筛选、分离、富集获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子.具有实用范围广、筛选过程简便、适配子有高特异性和高亲和性等特点.适配子的选择性在很多方面优于抗体,在分子识别研究中具有重要价值,可用于靶物质的测定、阻断靶物质的生物活性.本文综述SELEX技术及寡核苷酸适配子在丙型肝炎病毒诊断和治疗领域的最新进展,并且对其前景进行分析和预测.     

SELEX技术及核酸适配子在临床诊断中的应用前景

指数富集配体的系统进化技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子。适配子的靶分子广泛,与靶物质结合的亲和力高、特异性强,在制备及稳定性等方面优于抗体。基于适配子的生物芯片、生物传感器、分子信标等检测新技术已初步显示出良好的敏感性和特异性,在人类疾病诊断中具有良好的应用前景。     

酵母双杂交法对HBV表面抗原主蛋白候选结合蛋白的筛选

目的:自肝细胞cDNA文库中筛选与HBV主蛋白(SHBs)相互作用的蛋白基因,探讨主蛋白的生物学功能.方法:利用PCR扩增S主蛋白基因,定向克隆技术将靶基因克隆到pDEST32构建出S主蛋白的诱饵质粒:Western blot方法验证转化诱饵质粒的酵母细胞表达SHBs:将诱饵质粒与人肝cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,在营养缺陷型培养基和X-gal上进行三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母茵落的猎物质粒进行DNA测序;利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:构建S主蛋白及肝文库酵母细胞表达载体,进行酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,筛选出既能在缺陷培养基也能在X-gal的检测下变成蓝色的真阳性菌落3个,分别为核糖体蛋白L3、微管蛋白α-1a和α-2巨球蛋白.结论:用酵母双杂交技术筛选出3个与SHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,提示SHBs可能参与到肝细胞内部的多种生物学反应.     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体展示技术（PDT）在模拟表位的筛选、筛选特定靶分子的配体、蛋白与蛋白间相互作用、细胞信号转导等基础研究，疾病的治疗和致病机理研究以及疫苗的制备、基因工程抗体的研发等领域均有广泛应用。噬菌体抗体库技术是通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经过筛选后获得特异性抗体的技术。该技术融合了丝状噬菌体展示与抗体组合文库技术，得到的抗体称为噬菌体抗体。     

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10的高亲和性适体。方法体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX技术筛选获得CFP-10的适体库。将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验（enzyme-linkedoligonucleotide sorbent assay,ELOSA）测定亲和力。结果构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础。结论成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体。     

乙型肝炎病毒全S蛋白与纤维蛋白原α链的相互作用

目的:筛选人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白相互作用蛋白的基因,并反向验证HBV全S蛋白候选结合蛋白之间相互作用.方法:将全S基因定向克隆到酵母表达栽体pDEST 32,构建正向筛选的诱饵质粒并Western b1ot法验证其在酵母中的表达.将诱饵质粒与人肝细胞cDNA文库质粒共同转化MaV203酵母细胞,在人肝细胞cDNA文库筛选候选结合蛋白,提取阳性茵落质粒测序.并分析其生物学性质.将筛选出的纤维蛋白原α链中下游序列及不同全S变异株基因,分别定向克隆到pDEST32及pDEST22载体中,利用Western blot法验证表达.将诱饵质粒与猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,以反向酵母双杂交方法验证初筛结果的可靠性及正确性.结果:正向的酵母双杂交实验,经初筛和再转染实验纤维蛋白原α链可与HBV全S蛋白发生相互作用.再以纤维蛋白原α链为靶基因设计诱饵质粒,以四种变异的HBV全S蛋白为靶基因设计猎物质粒,反向酵母双杂交法证实维蛋白原α链中下游可与不同全S变异体(总差异率2%)发生相互作用,纤维蛋白原α链与全S蛋白的结合域可能为病毒蛋白的前268aa.结论:纤维蛋白原β链中下游可与HBV全S蛋白产生特异性结合,其结合域可能与病毒蛋白的前268aa产生相互作用.     

筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究

目的 建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10 的高亲和性适体.方法 体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX 技术筛选获得CFP-10的适体库.将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力.结果 构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体.     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因．方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3．1(-)- DNAPTP1 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建 cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库．文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段．对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列．结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索．     

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测

指数级富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELFEX)技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点,并已用于检测多种靶物质.目前利用适体检测MTB分泌蛋白64(MFT64)及模拟胸腔积液中γ-干扰素含量已有报道~([1-2]),由于MPI64是结核病血清学诊断的重要抗原之一,本研究旨在利用SELEX技术筛选MPT64抗体高亲和性适体并用于血清学检测,对获得的适体进行初步功能学评价.     

骨肉瘤特异生物诊断探针制备

目的构建与骨肉瘤细胞高亲和性与特异性结合的DNA寡核苷酸适配体库,用于骨肉瘤临床特异性诊断。方法体外合成40 nt高通量随机序列的单链DNA寡核苷酸文库(ssDNAs);骨肉瘤细胞(U-2 OS)作为目标细胞与文库ssDNAs反应;指数富集配体的系统进化(SELEX)技术用于筛选富集与靶细胞结合的寡核苷酸;聚合酶链反应(PCR)技术与亲和层析技术用于次轮反应文库的制备;应用荧光光谱跟踪筛选过程;对最后的筛选序列进行克隆、测序与保存。结果十一轮至十三轮筛选后的ssDNAs荧光光谱曲线显示了有意义重叠,因此结束筛选;对十三轮筛选的ssDNAs进行了克隆测序,依据一级结构的同源序列建立了寡核苷酸探针组群。结论应用SELEX技术最终从高通量的随机文库中获得了与U-2 OS具有高度亲和性的寡核苷酸适配体,适配体库的建立不仅仅用于骨肉瘤的特异性诊断,也将为探针-载体-抗肿瘤药物复合体的研制与实施骨肉瘤定向治疗搭建了可行性平台。     

泡沫细胞靶向适配子的体外筛选

目的筛选巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子,为动脉粥样硬化的靶向治疗提供实验依据。方法以80 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育THP-1巨噬细胞72 h,建立泡沫细胞模型;利用指数富集配基的系统进化技术,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选特异性寡核苷酸适配子;荧光显微镜观察寡核苷酸文库与泡沫细胞结合的特异性;克隆、测序确定适配子的序列并进行一级结构和二级结构分析。结果通过油红O染色和高效液相色谱分析,确定成功建立泡沫细胞模型;经过18轮的循环筛选,寡核苷酸文库仅与泡沫细胞结合,不再结合巨噬细胞、血管平滑肌细胞。测序鉴定出的所有适配子序列可以分为12个家族,没有共同的同源序列。二级结构分析表明,适配子主要形成茎环结构,这可能是适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞结合的结构基础。结论利用复合靶指数富集配基的系统进化技术成功筛选出巨噬细胞源性泡沫细胞的寡核苷酸适配子。     

人工进化丙型肝炎病毒C和E1区噬菌体展示文库的构建及初步筛选

目的构建人工进化丙型肝炎病毒(HCV)C和E1区基因噬菌体展示文库,并进行初步筛选。方法应用DNA改组技术进行不同基因型的HCV C和E1区基因的人工进化,克隆于噬菌体载体,以辅助噬菌体M13K07援救后,构建噬菌体展示文库,应用HCV C和E1区单克隆抗体进行初步筛选。随机选取筛选后的20个噬菌体克隆,用高滴度HCV阳性血清通过双抗体夹心酶联免疫吸附法进行抗原抗体结合反应,以正常人血清作为对照。结果人工进化HCV C和E1区噬菌体展示文库库容达1．64×106,重组率为0．86。以C和E1区单克隆抗体淘筛4轮,噬菌体展示文库得到特异性富集。筛选获得12个阳性克隆。结论所构建的噬菌体展示文库的库容和多样性符合筛选的要求。筛选获得的阳性克隆具有较好的抗原抗体结合反应活性,表现出较好的亲和力。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物贡和能量代谢相关的基因。     

日本血吸虫成虫cDNA文库基因筛选结果的分析

分离和鉴定抗原候选基因是日本血吸虫疫苗研制的主要内容,目前常用的办法是通过构建日本血吸虫生活史某一阶段的 cDNA 文库,采用核酸探针或抗体探针,从 cDNA 文库中筛选出特异性抗原基因,或通过 EST 技术利用生物信息学方法得到所需 cDNA 序列,进而可以在体外表达抗原性蛋白质,作进一步的研究。本文就日本血吸虫成虫cDNA 文库的筛选结果作一综述。     

布鲁氏菌外膜蛋白 VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析

目的 筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法 设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果 成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q₁₀和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论 本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。     

噬菌体展示肽库技术及其应用研究现状

噬菌体展示技术是将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，筛选功能性多肽的一种生物技术.该技术在抗原表位定位、免疫学诊断、疫苗研制、药物筛选等方面具有重要用途。     

白塞病相关自身抗原Kinectin的表达型cDNA文库筛选与鉴定

目的研究白塞病患者血循环中的自身抗体及其针对的细胞内靶抗原.方法应用免疫印迹-化学发光法对39例白塞病患者血清进行初步研究,以含有高滴度抗体的患者血清作为“探针”免疫筛选表达型λZAP噬菌体cDNA文库并鉴定候选克隆,通过真核转录、翻译以及免疫沉淀实验分析阳性克隆表达产物的抗原性.结果文库筛选获得6个独立候选克隆,均为人Kinectin部分全长cDNA,以其中最大克隆的基因表达产物为抗原基质的免疫沉淀研究显示,23.1%（9/39）的白塞病患者血清呈阳性反应,正常人以及系统性红斑狼疮、干燥综合征患者对照阴性.结论Kinectin是白塞病相关自身靶抗原;抗Kinectin抗体与白塞病免疫发病机制的关系值得深入探索,抗体可能对疾病具有潜在血清学诊断价值.     

酵母双杂交筛选Clathrin相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术从小鼠肺cDNA文库中筛选与Clathrin相互作用蛋白,进一步阐明Clathrin在急性肺损伤和急性呼吸窘迫症（ALI/ARDS）发生时肺泡上皮极性损伤中的具体作用机制。方法 首先构建酵母双杂交pSos-Clathrin诱饵载体,酶切鉴定,然后确定Clathrin诱饵蛋白无自激活特性并检测了Clathrin诱饵蛋白的表达;最后筛选小鼠肺cDNA文库并对筛选得到的阳性克隆进行回转验证,对回转验证结果为阳性的文库克隆质粒送检测序,分析克隆序列。结果 酵母双杂交筛选小鼠肺cDNA文库得到4个与Clathrin相互作用蛋白,分别是：腺苷酸环化酶关联蛋白1,细丝蛋白α,DAP凋亡诱导蛋白激酶2和G蛋白耦联受体激酶6。结论 Clathrin参与细胞极性调节、炎症损伤和细胞凋亡等过程。     

申克孢子丝菌菌丝相和酵母相cDNA消减文库的构建及差异表达基因的筛选

目的构建申克孢子丝菌双相cDNA消减文库,筛选与双相转换相关的差异表达基因。方法运用抑制性消减杂交技术,构建申克孢子丝菌菌丝相（Mycelium,M）和酵母相（Yeast,Y）的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析。结果 M＋Y文库获得751条表达序列标签（Expressed Sequence Tags,ESTs）,经拼接后获得101条uni-genes;Y＋M文库获得875条ESTs,拼接获得249条unigenes。申克孢子丝菌酵母相菌丝相的转换伴随着不同菌相细胞差异基因的高表达,这些高表达的差异基因可分为结构基因类、代谢酶类、细胞表面分子类及功能不明的细胞分子。结论成功构建了申克孢子丝菌双相转换相关的cDNA消减文库基础上,筛选出部分差异表达基因,为进一步研究申克孢子丝菌致病相关基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因

目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能.方法 应用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因.以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果 共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞牛长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索.