干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)启动子上所含的干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.     

人α-干扰素上单克隆抗体表现型结合位点的研究

单克隆抗体NK2特异地中和某些人α-干扰素(INF-α)亚种。如IFN-α2和IFN-αB(B)。作者用在酵母中生产的重组IFN-α2研究了NK2表现型。这些研究旨在搞清IFN分子上的受体     

细胞因子对HLA-B27启动子的调节作用及其在强直性脊柱炎发病机制中的意义

目的： 构建含HLA-B27启动子的HeLa稳定转染细胞株，观察7种细胞因子对HLA-B27启动子及其上游NF-κB及ISRE顺式作用元件活性的调节作用，探讨强直性脊柱炎（AS）等B27相关疾病的发生机制。方法:转染HeLa细胞，抗生素筛选单克隆构建含HLA-B27启动子的稳定转染细胞株。构建HeLa-B27稳定细胞株和HeLa-NF-κB稳定细胞株，在瞬时转染pISRE-luc的HeLa细胞中加入白细胞介素1α（IL-1α）、 白细胞介素1β（IL-1β）、 肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）、 干扰素γ（IFN-γ）和转化生长因子β（TGF-β），观察7种细胞因子对B27启动子及其上游NF-κB和ISRE作用元件的调节作用。另外在HeLa-B27 稳定细胞株培养液中同时加入3种细胞因子单克隆抗体和相应细胞因子，观察其对启动子活性的调节作用。结果:TNF-α、IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ 均能明显增强HeLa细胞B27启动子活性。细胞培养96 h 后，IFN-β为最强的启动子诱导剂（5.4倍，P<0.05）；细胞培养8 h 内，TNF-α、IL1-α 和 IL1-β,可诱导NF-κB的活性增加30倍左右（P<0.05），IFN-α 和IFN-β 可诱导ISRE的活性增加12倍左右（P<0.05），抗TNF-α 抗体对于I类IFN 增加的B27 启动子活性没有明显的抑制作用。结论：TNF-α和IFN 可通过结合于B27 启动子中各种转录因子结合元件调控HLA-B27启动子的转录活性，IFN-β 可能在强直性脊柱炎等B27 相关的脊柱关节病的发病机制中起着重要作用。     

I型干扰素信号通路与系统性红斑狼疮发病机制的研究进展

系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病,多数患者血清中干扰素-α（IFN-α）水平升高,并且在淋巴细胞和组织中出现大量IFN诱导应答基因。含有核酸的免疫复合物作为IFN—α的诱导物,结合外源性因素的作用,可激活体内依赖Toll样受体（TLR）和不依赖TLR等多条信号通路,刺激产生更多的IFN-α,形成恶性循环,启动和维持SLE的自身免疫过程。     

绿色荧光蛋白干扰素-α2b融合基因的构建与表达

干扰素-α2b（IFN-α2b）作为治疗慢性乙肝、丙肝的首选药物，已成为医药生物技术产业的重要产品。目前研究IFN与其受体的作用关系多采用酶联免疫吸附法，间接的分析IFN或测定其受体被封闭的情况，但在细胞水平直观实时的检测IFN与其受体相互作用关系的研究报道甚少。本研究利用来源于维多利亚水母的绿色荧光蛋白（GFP）作为分子标签，构建含有GFP与IFN-α2b融合基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。     

土拨鼠α干扰素新亚型基因的克隆及生物学活性分析

目的 克隆土拨鼠α干扰素（IFN-α）新亚型基因，用于土拨鼠HBV模型探索IFN-α治疗慢性乙型肝炎策略；调查慢性土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHY）感染的土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC）干扰素功能状况。方法 poly（I-C）体外刺激正常和慢性WHV感染的土拨鼠PBMC，分析其表达的干扰素生物学活性。利用分子克隆技术对土拨鼠IFN-α家族基因进行克隆，并对所克隆的系列基因进行测序、分型并进行真核表达后检测表达产物生物学活性。结果 poly（I-C）刺激体外培养的土拨鼠PBMC后，慢性感染土拨鼠PBMC分泌的干扰素的活性显著差异低于正常土拨鼠（P〈0．01）。获得36个土拨鼠IFN-α基因序列克隆，测序分析后，发现有10个克隆是新亚型基因，其中8个为功能基因亚型，2个为假基因亚型，病毒保护试验证明只有功能基因亚型具有生物学活性。结论 慢性WHV感染的土拨鼠细胞免疫功能受损。新的土拨鼠IFN-α亚型基因的克隆为在土拨鼠HBV动物模型上进行干扰素基因治疗和研究干扰素治疗策略提供了新的材料。     

一种新的土拨鼠α干扰素基因分型方法的建立及其意义

目的：建立新的土拨鼠α干扰素（IFN-α）基因分型方法，分析急性和慢性土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepati-tis virus，WHV）感染的土拨鼠肝细胞中不同型别的IFN-α基因表达谱及其意义。方法：利用已知序列和基因型的土拨鼠IFN-α基因克隆质粒，建立基于土拨鼠IFN-α基因序列的限制性片段长度多态性的土拨鼠IFN-α基因分型方法。PolyIC体外刺激正常土拨鼠外周血单个核细胞（PBMC），调查正常土拨鼠PBMC受PolyIC刺激后IFN-α基因的表达谱。提取急性和慢性土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠肝组织mRNA，RT-PCR扩增土拨鼠IFN-α基因，分子克隆后调查急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因表达谱。结果：建立了土拨鼠IFN-α基因限制性片段长度多态性分型方法。急性和慢性感染的土拨鼠肝细胞中IFN-α基因的表达谱明显不同于正常动物的表达谱，假基因表达所占比例大。结论：新建立的土拨鼠IFN-α基因分型方法可用于分析土拨鼠不同组织中IFN-α的基因表达谱。     

以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

IFN-γ诱导人单核细胞MICs分子表达

目的：研究IFN-γ对MHC—I类链相关分子（MICs）表达的调节作用。方法：采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC），以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞，以细胞因子IFN-γ、TNF-α或IFN—α刺激PBMC、纯化单核细胞或单核细胞系U937、THP-1后，以流式细胞术检测单核细胞表面MICs分子表达。结果：IFN-γ选择性上调人PBMC中单核细胞表面MICs表达；IFN-γ对人原代单核细胞及单核细胞系U937、THP-1细胞表面MICs分子表达均有诱导或上调作用，细胞因子TNF—α、IFN—α对单核细胞MICs分子表达无影响。IFN-γ诱导或上调表达的MICs分子不能被MICA或MICB特异性单克隆抗体（mAb）所识别，可能是一种新的MIC分子或MIC等位基因。结论：IFN-γ能诱导或上调人单核细胞表面MICs分子表达。     

IFN-α诱导HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G的表达

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α(0 U/ml、100U/ml、400U/ml、800U/ml and 1200U/ml)刺激,10h后提取细胞总RNA,RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBEC3G的mRNA水平变化,Western blot分析APOBEC3G蛋白水平的表达;分别构建不同长度的含有IRF-E(IFN regulatory factor element)位点的APOBEC3G起始密码上游序列报告质粒、不含IRF-E和IRF-E位点突变的虫荧光素酶报告质粒,报告基因分析IFN-α刺激后APOBEC3G起始密码上游IPF-E位点对APOBEC3G表达的影响。结果IFN-α上调HuH7细胞APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,并具有剂量依赖的效应。序列分析发现APOBEC3G起始密码上游的-298～-283和-57～-47位碱基分别存在IRF-E和ISRE(IFN stimulated re- sponse element)序列。报告基因分析结果显示,干扰素使含有IRF-E序列的APOBEC3G启动子报告质粒的虫荧光素酶的活性增加6～8倍,而不含IRF-E序列和IRF-E位点突变的报告质粒的虫荧光素酶活性在干扰素刺激后几乎没有变化。结论IFN-α可通过IRF-E位点上调APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,从而发挥抗病毒效应。     

重组疫苗E. coli LLO/OVA促进小鼠树突状细胞NOD1受体活化并表达IFN-γ

目的探讨重组疫苗E.coli LLO/OVA诱导树突状细胞的细胞内受体NOD(nucleotide-binding oligomerizationdomain)活化及表达IFN-γ的作用。方法采用基因芯片杂交分析经E.coliLLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞(bonemarrow-derived dendritic cells,BMDC)Card4/NOD1及其下游NF-κB信号通路相关分子mRNA的表达,RT-PCR检测BMDC的NOD1、NOD2和IFN-γmRNA表达,ELISA测定BMDC培养上清液内IFN-γ含量。结果经E.coli LLO/OVA刺激后4h至8h,BMDC出现Card4/NOD1基因表达上调,其下游信号途径相关分子基因Rip2、Ikkα、Ikkβ、Nfκb1、Nfκb2和IFN-γ均出现表达上调。RT-PCR结果显示该疫苗刺激后BMDC的NOD1与IFN-γ基因表达时段一致。经E.coliLLO/OVA刺激后24h,BMDC培养上清液内IFN-γ含量明显高于E.coli OVA刺激后的BMDC。结论重组疫苗E.coliLLO/OVA诱导小鼠骨髓树突状细胞NOD1受体信号途径活...     

GEFH1在LPS诱导树突细胞IL-6和IL-12a表达中的作用

为探讨GEFH1与树突细胞(dendritic cell,DC)TLR4两条下游信号途径的关系,从野生型和TRIF基因、IFNα/β受体基因敲除小鼠中分离和培养DC,LPS或IL-6刺激后收集细胞制备总cDNA,通过实时定量PCR检测GEFH1的mRNA表达。再用GEFH1的siRNA转染DC,LPS刺激后检测IL-6和IL-12a的mRNA表达。结果,在LPS刺激后,GEFH1的mRNA表达在野生型小鼠的DC中显著增加,在TRIF基因、IFN-α/β受体基因敲除小鼠的DC中则未被上调。此外,GEFH1siRNA处理后,IL-6和IL-12a的mRNA表达均上升显著(P0.05),而在IL-6刺激的野生型小鼠的DC中,GEFH1的mRNA没有明显改变。以上结果提示在转录水平,TRIF-IFNβ信号通路、而非IL-6可诱导GEFH1基因表达。GEFH1可能对MyD88途径中细胞因子IL-6和IL-12a的表达有负调节作用。     

Notch通过抑制信号调节蛋白α(SIRPα)调控巨噬细胞M1型极化作用

目的 研究缺刻基因(Notch)信号通过信号调节蛋白α(SIRPα)调控巨噬细胞极化的作用.方法 将小鼠RAW264.7细胞分别给予脂多糖(LPS)与γ干扰素(IFN-γ)或者白细胞介素4(IL-4)刺激极化为M1/M2后,通过实时定量PCR检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12、IL-10、甘露糖受体(MR)及...     

诱导活化的外周血单个核细胞THANK表达的初步研究

目的 分析不同刺激下外周血单个核细胞（PBMC）中THANK基因的表达,并克隆全长的人THANK基因,方法 采用将常规方法分离的外周血单个核细胞（PBMC）培养于含100ml/L FCS的RPMI1640中,并以不同浓度的LPS、TNF-α、IL-2、IFN-γ、PHA及PMA刺激不同时间,以RT-PCR法,分析PMBC中THANK基因的转录表达,并克隆相应的全长人THANK基因,结果 RT-PCR分析表明,当用IFN-γ刺激PMBC72h后,可诱导THANK基因明显表达;而IL-2、LPS、TNF-α、PHA和PMA则不能诱导其表达。采用PCR产物克隆的方法,克隆了人THANK基因,并经DNA序列测定证实,结论 克隆得到人THANK基因,并经DNA序列测定证实,结论 克隆得到了人THANK基因,为进一步研究THANK的功能打下了基础。     

IFN-α和IFN-γ逆转MR2细胞维甲酸耐药的实验研究

目的:探讨IFN-α和IFN-γ与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合逆转MR2细胞对ATRA耐药的可能性及其机制。方法:IFN-α、IFN-γ及ATRA单独或两种IFN分别与ATRA联合作用于对ATRA耐药的细胞株MR2后,采用MTT比色法检测细胞的增殖,用光镜观察、NBT还原实验及流式细胞仪检测细胞的分化,用间接免疫荧光法检测早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白的表达。结果:两种IFN均能抑制MR2细胞的增殖;IFN与ATRA联合应用时抑制作用更加显著;但两种IFN无论是单独应用还是与ATRA联合应用,二者之间均无统计学意义(P>0.05)。两种IFN也能诱导MR2细胞发生一定程度的分化;二者分别与ATRA联合应用时作用更加显著,但IFN-γ ATRA组诱导MR2细胞分化的作用明显强于IFN-α ATRA组(P<0.05)。两种IFN都能诱导PML蛋白的表达。结论:IFN-γ与ATRA联合应用逆转MR2细胞对ATRA耐药的作用强于IFN-α与ATRA的联合,可能与IFN-α和IFN-γ信号传导途径的不同有关。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析

目的 确定乙型肝炎病毒（HBV）DNA聚合酶末端蛋白（terminal protein，TP）抗α-干扰素（IFN-α）的功能区域。方法 PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中，构建IFN—α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激，ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的表达，建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP（包括Spacer区）基因缺失突变体重组真核表达载体，通过融合表达的多肽表位抗体，Westernblot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用，并据此确定TP（包括Spacer区）抗IFN-α作用的功能区域。结果 获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强，且在IFN-α2a终浓度为100IU／ml时达到最大。Westem blot显示，IP（包括Spacer区）各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分／全长1P的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下，胞内CAT值和对照组相比无显著差别，相反，全长TP＋部分／全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论 DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。     

IFN-λ在人食管癌细胞系中诱导的生物学活性的初步研究

目的 初步研究IFN-λ在7种人食管癌细胞系中诱导的生物学作用。方法 PCR检测IL-28α和IL-10β的基因及抗病毒分子基因的表达,流式细胞术检测主要组织相容性抗原的表达及细胞周期,二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖。结果 各食管癌细胞表达IL-28α和IL-10β的基因;IFN-λ诱导或上调2′5′-寡腺苷酸合成酶（2′5′-OAS）和黏病毒抗性蛋白A(MxA)的基因表达;IFN-λ可上调Ⅰ类主要组织相容性抗原分子的表达;IFN-λ可通过调控细胞周期的方式抑制食管癌细胞生长增殖。结论 人食管癌细胞株表达IFN-λ受体复合体,IFN-λ具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的生物学活性。     

重组疫苗E.coli LLO／OVA经TLR4和NOD1受体诱导树突状细胞表达细胞因子

目的:探讨树突状细胞(DC)的模式识别受体(PPBs)活化与细胞因子表达的关系.方法:采用基因芯片及RT-PCR检测经E.coli LLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞(bone marrw-derived dendritic cell,BMDC)的PPRs及其下游NF-KB信号通路相关分子mRNA的表达水平,并观察BMDC的活化状况及培养上清液内细胞因子含量.结果:经E.coliLLO/OVA刺激后2 h,BMDC出现短暂的TLR4 mRNA表达上调,其下游信号途径相关的Myd88、Rip2、Irak1、Imk2、Ikkα、NF-KB1和NF-KB2 mRNA均出现表达上调,黏附分子Icam1、细胞因子IL-1α、IL-1b、IL-6和TNF-α的mRNA也表达上调;经E.coli LLO/OVA刺激后4 h,BMDC出现Card4(NOD1)mRNA表达上调,其下游信号途径相关的Rip2、Ikkβ、NFkB1和NF-KB2 mRNA均出现表达上调,IFN-γ、TNF-β和CD40 mRNA也上调表达.经E.coli LLO/OVA刺激后24 h,BMDC表达共刺激分子及MHC-Ⅱ类分子上调;且培养上清液内IL-12和IFN-γ含量增高.结论:重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和NOD1受体激活NF-KB信号通路,诱导了小鼠BMDC成熟并表达一系列细胞因子尤其是IL-12和IFN-γ.     

寻常性银屑病患者外周血干扰素γ和肿瘤坏死因子α及其受体mRNA的测定

目的 研究外周血干扰素(IFN)-γ,mRNA和肿瘤坏死因子(TNF)-α及其受体mRNA在寻常性银屑病患者中的表达.方法 选择2010年8月至2013年8月本院50例寻常性银屑病患者为观察组,将观察组患者按是否为进行期分两亚组,进行期为观察组A(28例),静止期为观察组B(22例);选另同期本院体检中心体检的健康者30例为健康对照组.采集各组外周静脉血,进行血清IFN-γ和TNF-α水平检测,同时检测其PBMC中IFN-γ受体mRNA和TNF-α受体mRNA的表达情况.结果 观察组患者血清IFN-γ和TNF-α水平均高于健康对照组[(8.46±2.72)比(5.61±2.43) pg/mL;(44.28±8.61)比(3.26±6.85) pg/mL,均P＜0.05];观察组A中IFN-γ受体mRNA及TNF-α受体mRNA的表达水平高于观察组B[(1.21±0.23)比(0.75±0.38);(2.63±2.18)比(1.58±1.17),均P＜0.05],而观察组B中IFN-γ受体mRNA及TNF-α受体mRNA的表达水平高于对照组,但差异无统计学意义[(0.75±0.38)比(0.64±0.27);(1.58±1.17)比(1.24±1.23),均P＜0.05];PASI评分不因IFN-γ受体mRNA和TNF-α受体mRNA表达水平的变化而变化(r=0.15,P＞0.05).结论 银屑病患者进行期时,IFN-γ受体mRNA及TNF-α受体mRNA的表达明显升高,银屑病的发病作用机制与IFN-γ受体mRNA及TNF-α受体mRNA的表达可能相关.