HIV-1包膜糖蛋白侵入靶细胞作用机制研究进展

在HIV-1感染宿主细胞过程中，其包膜糖蛋白在病毒的侵入中起关键的作用。首先外膜糖蛋白gp120识别宿主细胞表面的CD4分子和一种趋化因子受体，并与之结合进而导致病毒包膜糖蛋白的构象改变，暴露出跨膜糖蛋白gp41，其在诱导膜融合的过程中发生一系列构象变化，进而引起HIV-1包膜与宿主细胞质膜相融合，使得HIV-1核心颗粒进入宿主细胞中。     

HIV-1 膜蛋白基因片段杆状病毒转移载体克隆及重组体的构建

目的：构建编码HIV－1外膜糖蛋白的gp120和gp41基因杆状病毒转移载体，并在昆虫细胞中表达gp120和gp41重组蛋白。方法：从HIV－1基因克隆PNL4－3（NY5／LAV）中应用聚合链反应扩增目的基因gp120和gp41，克隆到PGEM－T载体中，限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定目的基因，再经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆到杆状病毒转移载体PAC－SecG2T中，再次测序鉴定。通过在sf9昆虫细胞中同源重组、空斑筛选、病毒鉴定、SDS－PAGE、Western-blot对重组病毒和重组蛋白进行分析。结果：限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，gp120和gp41正确克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中；SDS－PAGE和Eestern-blot结果表明在昆虫细胞中成功表达了HIV外膜糖蛋白gp120和gp41。结论：成功构建了PACSecG2T-gp120和PACSecG25-gp41杆状病毒转移载体，并在杆状病毒－昆虫细胞表达系统中表达了HIV－1 gp120和gp41重组蛋白，Western-blot证明具有较好的免疫原性。     

HIV-1包膜V3区在病毒侵入靶细胞中的增强作用

目的　明确Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirustype 1,HIV 1)包膜糖蛋白gp12 0第三可变区 (variableregion ,V3)在病毒进入靶细胞的早期阶段中的作用。方法　合成了 3个环状V3多肽 ,包括V3 BH10、V3 ADA和V3 89.6以及直链和短链多肽V3 BH10 /CA、V3 NNT2 4和V3 IRI12。构建了 3株分别带HIVHXB2株、ADA株和 89.6株包膜的伪病毒并观察了多肽对不同嗜性HIV侵入靶细胞能力的影响。结果　 (1)HIV 1V3区多肽以毒株特异性模式增强HXB2、ADA和 89.6进入靶细胞 ;(2 )直链V3多肽与其环状多肽具有相似作用 ;带有C末端的短肽V3 NNT2 4也有与长链V3 BH10 /CA相近的作用 ,只有中央保守区的短链V3 IRI12没有类似功能。结论　本研究首次发现HIV 1V3区在病毒进入靶细胞早期阶段中具有毒株特异性增强病毒侵入的作用。该发现有助于进一步明确HIV 1进入靶细胞的机制     

HIV-1囊膜糖蛋白gp41三聚体结构域基因的表达及其单克隆抗体的制备

目的：表达HIV-1囊膜糖蛋白gp41三聚体结构域基因N51(L6)C46融合蛋白，并制备针对该融合蛋白的单克隆抗体(mAb)，为筛选抗HIV多肽及分析gp41表位的免疫原提供抗体工具。方法：在B121(DE3)中诱导表达NSl(L6)C46融合蛋白，经mAb NC-1鉴定后，采用小鼠腹股沟皮下NC膜免疫的方法免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化制备抗N51(L6)C46 mAb，用ELISA法初步鉴定其特异性位点。结果：获得了高表达的N51(L6)CA6融合蛋白，并能与识别特异性空间构象的mAb NC-1反应。用该融合蛋白免疫小鼠后，获得了6株抗N51(D5)C46的mAb，这6株mAb均特异识别兔抗N36(L6)C34抗体捕获的融合蛋白，但不与N36或C34多肽片段反应。结论：得到高效表达融合蛋白N51(L6)CA6，并呈现gp41核心结构空间构象。用此蛋白免疫小鼠得到6株特异结合gp41核心结构空间构象的单抗。     

原代HIV-1包膜糖蛋白修饰体诱导小鼠产生高滴度gp120抗体

目的 探索1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜糖蛋白修饰对包膜免疫原性的的影响.方法 通过PCR扩增获得原代HIV-1 06044株包膜gp120基因及其突变体gp120/W427S基因,并构建gp120三聚体蛋白真核表达载体pcT-gp120和pcT-gp120/W427S,重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK2...     

HIV-1包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片电生理特性的影响

目的探讨人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及突触传递的影响。方法用盲法全细胞记录技术,观察gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠海马长时程增强效应(LTP)的影响。结果①在电流钳,gp120可使终末去极化电流激发快速动作电位的数目增加;②在电压钳,gp120对大鼠海马CA1区神经元的全细胞电流无明显作用;③将gp120(100 pmol/L)与海马脑片共孵育1h后,在钳制电压为-60 mV时,发现HFS后海马CA1区的兴奋性突触后电流(EPSC)显著减小,LTP的强度减少到(108.5±8.0)%(n=11,P<0.01)。结论gp120可使海马神经元的兴奋性增加,并可能通过抑制海马CA1区的LTP诱发参与艾滋病痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的病理生理过程。     

HIV 外膜糖蛋白 gp120 和 gp41 在昆虫细胞中表达及其免疫学特性的评价

将编码完整ｇｐ１２０和完整ｇｐ４１的基因分别克隆到杆状病毒转移质粒中。使用重组转移质粒与野生杆状病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经挑选获得分别带有编码ｇｐ１２０和ｇｐ４１基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中分别表达了ＨＩＶ外膜糖蛋白ｇｐ１２０和ｇｐ４１。其重组蛋白的分子量分别为１２０×１０３和４１×１０３。此重组糖蛋白在免疫荧光、免疫印染和酶联免疫实验中都能被ＨＩＶ阳性血清所识别。动物免疫实验表明此重组糖蛋白能诱导很强的特异性抗体产生。     

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)糖蛋白gp120部分糖基化位点突变对其抗原性影响

目的 研究HIV-1包膜糖蛋白gp120特定糖基化位点突变后对gp120抗原性的影响,并推测糖基化位点突变对结构的影响.方法 采用连接PCR方法,将获得的野生型gp120中选定N糖基化位点的Asn定点突变为Cln,使该位点去糖基化,构建DNA疫苗,免疫小鼠,ELISA检测鼠血清中的抗体,进行统计学分析,推测糖基化位点突变对gp120抗原性和结构的影响.结果 2组糖基化位点突变的gp120诱发非V3特异性抗体的能力较之野生型gp120有明显提高,但诱发V3特异性抗体能力没有显著提高,7个位点突变的gp120诱发V3特异性抗体能力有很大降低.结论 gp120部分糖基化位点的突变在一定程度上能提高或改变gp120的抗原性,这可能由突变导致的构象变化和/或糖基化寡糖链移除使原来被遮盖的抗原表位暴露引起.     

抗HIV-1 gp120单链抗体基因的克隆及序列测定

人Ⅰ型免疫缺陷病毒(HIV-1)的外膜蛋白gp120在病毒的感染侵入过程中发挥重要的功能[1]。gp120的单克隆抗体在HIV-1感染的诊断和治疗中起着十分重要的作用[2],但鼠源性抗体因在人体内可产生较强的免疫原性,因此限制了它的应用。利用基因工程手段制备单链抗体ScFv可以克服鼠源单抗的这一缺点,又可进行大规模表达,因此具有重要的临床意义。本实验分离制备抗HIV-1gp120的单链抗体基因,为今后的进一步应用打下了基础。1材料与方法[3]1.1材料杂交瘤细胞株102,分泌抗HIV-1外膜蛋白gp120的单克隆抗体,由本室制备保存;各种内切酶及修饰酶均购自…     

HIV-1gp41核心结构模拟位的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定HIV-1 gp4l核心表位。方法：用识别HIV-1 gp41的构象特异性单克隆抗体NC-1筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、NC-1特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆，DNA序列分析阳性克隆。结果：经3轮筛选，随机挑取24个噬菌体克隆，ELISA鉴定表明有lO个克隆可与NC-1结合，DNA序列分析并推导氨基酸序列，共5种序列：HDVHHRWVYLLS、ITVNEWLYTSEQ、HGRSHGMFKPKR、MGPIARPHWHLN、DMYRSPRPKPDT。其中gp41N肽和C肽所形成的复合物可特异性阻断表达HDVHHRWVYLLS，VNEWLYTSEQ和MGPIARPHWHLN的克隆与NC-1的结合。结论：所得序列HDVHHRWVYLLS，VNEWLYTSEQ及MGPIARPHWHLN模拟HIV-1 gp41六螺旋束核心表位。     

在鸡痘病毒中共表达HIV-1 gp120与IL-2基因

外膜蛋白gp120是HIV—1主要结构蛋白之一，它的V3区存在着中和抗体决定簇、CTL决定簇，以及对巨噬细胞和脑组织纤维特异性识别的区，与HIV—1可诱导中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分子致病机制密切相关。针对V3环的抗体可干扰gp120和CCR5之间的结合，这一发现为艾滋病的预防和治疗提供了新的途径。现已证明，多数细胞因子具有良好的免疫佐剂性能，对免疫应答具有刺激作用。本研究拟利用我国鸡痘病毒疫苗株为载体，构建可共表达HIV-1 gp120与IL-2基因的重组鸡痘病毒载体，为开发HIV重组病毒活载体疫苗提供一种安全的新途径。     

gp120对体内免疫细胞的作用

gp12 0是HIV病毒的衣壳蛋白 ,由基因env编码 ,其分子量为 12 0KD。在病毒侵入人体T细胞的过程中发挥重要的作用 ,同时它还存在游离态的形式 ,通过一种类似于超抗原作用的途径 ,在体内非特异性地激活一些主要的免疫细胞 ,从而大大增强了HIV对人体的危害作用。本文拟就HIV病毒危害人体免疫功能的最新研究作一综述     

030 gp120对体内免疫细胞的作用

gp120是HIV病毒的衣壳蛋白,由基因env编码,其分子量为120KD.在病毒侵入人体T细胞的过程中发挥重要的作用,同时它还存在游离态的形式,通过一种类似于超抗原作用的途径,在体内非特异性地激活一些主要的免疫细胞,从而大大增强了HIV对人体的危害作用.本文拟就HIV病毒危害人体免疫功能的最新研究作一综述.     

HIV-1包膜蛋白gp120在神经元损伤诱发认知障碍中的作用

目的探索HIV-1包膜蛋白gp120在神经元损伤引起认知障碍中的作用。方法免疫印迹和免疫荧光检测gp120处理后的小胶质细胞活化、炎症因子表达和神经元损伤情况;免疫组化分析gp120转基因小鼠的神经元损伤情况;行为学分析转基因小鼠的神经认知状况。结果体内和体外试验结果表明HIV-1 gp120可显著诱导caspase-1与IL-1β表达,并间接引起神经元突触变短和神经元损伤(P<0.05);与野生型小鼠相比,gp120转基因小鼠出现明显的皮层和海马回小胶质细胞激活、神经元丢失与树突损伤以及神经认知紊乱现象。结论HIV-1 gp120可能通过激活小胶质细胞炎症因子释放导致神经元损伤并可能与神经认知障碍发生相关。     

HIV-1 gp120蛋白对人血-视网膜屏障细胞的毒性作用

目的 探索HIV-1 gp120蛋白侵犯人血.视网膜屏障的机制.方法 原代培养人血-视网膜屏障细胞(HBRBC),包括人视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)、人视网膜微血管周细胞(HRCPC)、人视网膜色素上皮细胞(HRPE),以培养基作为对照.用MTT法观察7种不同浓度(0.01～0.15 mg/L)的HIV-1 gp120蛋白作用24 h和0.08 mg/L HIV-1 gp120蛋白作用不同时间(4～72 h)对3种细胞的生长抑制作用.0.08、0.1、0.12、0.15 mg/L的HIV-1 gp120蛋白作用24 h后,用流式细胞仪检测其对3种细胞凋亡率和线粒体膜电位(△ψm)的影响;用Western免疫印迹检测Cleaved cagpase-9蛋白的活化情况.用透射电镜观察经0.08 mg/L HIV-1 gp120蛋白处理24 h前后3种细胞超微结构的变化.结果 HIV-1gp120蛋白作用24 h,低浓度(<0.08mg/L)对3种细胞的活性均没有明显影响,而当浓度超过0.08mg/L时,对细胞的增殖活性有明显的抑制作用,呈浓度依赖性(HRCEC:r=-0.763,P<0.01;HRCPC:r=-0.804,P<0.01;HRPE:r=-0.698,P<0.01).HIV-1 gp120蛋白(0.08mg/L)作用12 h即可显著抑制细胞的增殖活性.24、48和72 h抑制效应更明显,相对增殖率分别为HRCEC:84%、70%、41%、22%,HRCPC:80%、69%、38%、18%,HRPE:86%、73%、45%、26%,抑制效应呈时间依赖性(HRCEC:r=0.833.P<0.01;HRCPC:r=-0.784,P<0.01;HRPE:r=-0.701,P<0.01).HIV-1 gp120蛋白作用24 h后与对照组相比,各浓度组3种细胞凋亡率增加、△ψm明显降低以及Cleaved cagpase-9蛋白表达增强,均呈浓度依赖性.透射电镜示0.08mg/LHIV-1 gp120蛋白处理24h后,3种细胞均出现了线粒体肿胀、溶酶体增多等早期凋亡的微观改变.结论 HIV-1 gp120蛋白能够抑制人血-视网膜屏障细胞的增殖并具有诱导凋亡的作用,破坏线粒体的结构和功能是其可能的机制.     

携带中国株HIV-1 gp120基因的重组腺病毒的构建及其感染巨噬细胞的形态学研究

目的: 构建携带中国株HIV-1 gp120基因并可感染小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)的重组腺病毒。方法: 利用AdMax腺病毒构建系统,以双质粒共转染人胚肾转化细胞293Ad5⁺细胞,完成重组腺病毒载体包装,并进一步扩增和纯化。通过ELISA测定gp120的蛋白产量,以确认目的基因重组与表达成功。以Karber法对病毒进 行TCID₅₀滴度测定,利用BMM进行感染复数(MOI)流式细胞术测定,并利用荧光显微镜观察细胞活化形态。结果: 成功构建AdMax-HIV-1 gp120(简称Ad-gp120)及其对照病毒(Ad-GFP),其滴度分别为10^8.3和10^8.1 TCID₅₀/mL。这些病毒可感染BMM,MOI测定结果表明2种重组腺病毒感染BMM和293Ad5⁺细胞的能力接近,验证了上述TCID₅₀滴度结果。Ad-gp120可在293Ad5⁺细胞中表达gp120蛋白,并可感染和诱导BMM相关形态改变。结论: 成功构建Ad-gp120,其感染可致BMM出现形态发生改变。     

模拟HIV-1 gp41 CHR表位短肽的筛选及研究

目的 利用针对HIV-1跨膜蛋白gp41CHR序列合成肽C34的单克隆抗体1G1筛选噬菌体12肽库，旨在找寻模拟C34肽表位的序列，同时探索该短肽成为HIV-1gp41NHR与CHR结合抑制物的可能性。方法 以1G1为钓饵蛋白对噬菌体12肽库进行亲和筛选，以双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 经3轮筛选后，随机挑选17个噬菌体克隆，其中6个克隆与1G1显示出较强的结合活性，上述6个阳性克隆经DNA测序，氨基酸序列相同；HYEFWAWNWEAN，其明显的疏水性质类似于G34N末端，特异性鉴定显示这些克隆均能够与HIV-1gp41N多肽结合，结论 该噬菌体克隆展示肽可模拟HIV-1gp41CHR多肽表位，并可与N多肽结合。     

共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选

目的构建共表达中国株HIV1gaggp120与白细胞介素6(IL6)的重组鸡痘病毒(FPV)。方法分别将HIV1gaggp120基因和IL6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTAGEIL6。利用脂质体法将重组质粒和FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDSPAGE和WesternBolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性。结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,WesternBolt结果显示重组病毒表达了gaggp120嵌合蛋白和IL6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白。小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性。结论成功构建了共表达中国株HIV1gaggp120与IL6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础。