细胞因子IL-10对ICOS-GL50信号介导的T细胞依赖性B细胞产生抗体的促进作用

目的研究ICOS—GL50信号在T细胞依赖性B细胞体外增殖、抗体分泌中的作用,进一步探讨细胞因子IL-10对ICOS-GL50信号介导的体液免疫中的作用。方法分别采用台盼蓝活细胞计数法和ELISA法检测ICOS—L929基因转染细胞和细胞因子IL—10对PWM介导的B细胞体外增殖及分泌抗体的效应。结果ICOS-L929基因转染细胞能够促进PWM介导的B细胞体外增殖,而不能显著上调抗体的分泌;加入IL-10后,能显著促进PWM介导的B细胞体外增殖和抗体分泌。结论细胞因子IL-10在ICOS—GL50信号介导的机体T细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥着重要的协同作用。     

PEX基因对肿瘤细胞生物学性状的影响

目的　探讨PEX基因在体外对鼠黑色素瘤细胞B16F10生物学性状的影响。方法　利用脂质体介导转染法,经G4 18稳定筛选后,应用MTT、流式细胞术、软琼脂克隆形成实验及Boyden小室侵袭实验,体外观察PEX基因对B16F10细胞生物学性状的影响。结果　BpcDNA sPEX、BpcDNA、B16F10三组细胞生长速度、细胞周期各时相均无明显差异(P >0 . 0 5 ) ;BpcDNA sPEX组细胞集落与BpcDNA组和B16F10组相比统计学上存在显著性差异(P <0 . 0 1) ,BpcD NA sPEX组细胞集落比BpcDNA组和B16F10组少,且单个集落中细胞数目少;BpcDNA sPEX组细胞穿透Matrigel胶能力比BpcDNA和B16F10组细胞弱,统计学上存在显著差异(P <0 . 0 1)。结论　PEX基因转染对体外单纯培养的B16F10细胞生长、增殖无影响;PEX基因可抑制B16F10细胞在软琼脂中形成集落的能力及体外侵袭能力。     

99mTc-AnnexinB1的制备及其探测细胞凋亡的实验研究

目的 制备99mTc-Annexin B1并对其体外、体内生物分布以及探测体内细胞凋亡的潜力进行评价.方法 应用99mTc直接标记蛋白质的方法制备99mTc-Annexin B1.采用与活化人血小板结合实验检测99mTc-Annexin B1的体外生物活性.在正常小鼠体内进行生物分布研究.采用地塞米松诱导小鼠胸腺凋亡的动物模型和anti-Fas单抗诱导小鼠肝脏凋亡的动物模型检测99mTc-Annexin B1探测体内细胞凋亡的潜力,并用TUNEL染色证实细胞凋亡.结果 直接标记法制备的99mTc-Annexin B1具有很高的放射化学纯度和很好体外稳定性.与活化人血小板的结合实验表明,99mTc-Annexin B1具有与PS结合的体外生物活性.99mTc-Annexin B1在体内具有较快的清除特性,主要聚集于肾脏.地塞米松诱导18 h后,小鼠胸腺对99mTc-Annexin B1的摄取显著高于对照小鼠胸腺的摄取.Anti-Fas诱导后2 h时后,小鼠肝脏对99mTc-AnnexinB1的摄取显著高于为对照动物的肝脏摄取.结论 99mTc-Annexin B1具有与PS结合的体外生物活性和探测体内细胞凋亡的潜力,是一种新的细胞凋亡显像剂.     

七氟烷通过NF-κB信号通路对脑损伤后神经元细胞的修复作用机制研究

目的 分析七氟烷通过核因子κB(NF-κB)信号通路对脑损伤后神经元细胞的修复作用机制.方法 对N9细胞进行体外培养,并随机数字表法分为3组(n=6).模型组细胞行氧糖剥夺-复氧复糖,七氟烷组细胞经七氟烷预处理后行氧糖剥夺-复氧复糖,对照组细胞不作处理.使用MTT法检测细胞存活率和吸光度(A)值,使用流式细胞术检测细胞...     

白细胞介素7增强急性白血病细胞B7分子表达和免疫原性的研究

目的 探讨白细胞介素7(IL-7)对急性白血病(AL)细胞B7分子表达和免疫原性的影响。方法 用流式细胞术检测AL原代白血病细胞R7分子的表达。体外用IL-7诱导白血病细胞。分析其对B7分子蛋白表达的影响，进而用RT-PCR检测B7-1和B7-2 mRNA表达。MTT法检测诱导后白血病细胞对异基因外周血单个核细胞(PBMNC)的刺激作用，并用酶联免疫吸附法(ELISA)测定上清液中1干扰素(IFNγ)含量：应用B7-1、B7-2和W6／32单抗阻断实验研究B7分子刺激PBMNC的机制。结果 11例AL患中B7-1弱阳性3例，B7-2弱阳性1例。IL-7能显刺激白血病细胞B7-1和B7-2表达，呈时间依赖性。IL-7作用于HL-60细胞可诱导B7-1和B7-2 mRNA表达。诱导后的白血病细胞显刺激PBMNC增殖并产生IFNγ。B7-1单抗和W6／32单抗可抑制白血病细胞诱导PBMNC增殖和产生IFNγ，而B7-2单抗无抑制作用。结论 原代AL细胞低表达B7-1和B7-2分子。在体外，IL-7通过诱导白血病细胞B7-1分子表达，刺激淋巴细胞增殖，使PBMNC分泌IFNγ增多，显提高了白血病细胞的免疫原性。在共刺激分子诱导抗白血病T细胞免疫反应巾，B7-1作用显强于B7-2。     

B7-H1基因在白血病细胞中的表达及其临床意义

本研究通过检测B7-H1基因在多种白血病细胞中的表达水平,探讨其临床意义。采用SYBR GreenⅠ实时定量PCR法检测9株白血病细胞系、4株IFN-γ体外诱导后的白血病细胞系,59例原代急性白血病细胞、10例原代白血病细胞诱导生成的树突状细胞(DC)以及2株实体肿瘤细胞系,10例正常人骨髓单个核细胞中B7-H1mRNA的表达水平,并对59例急性白血病患者的治疗反应与其白血病细胞中B7-H1基因表达水平之间的相关性进行了分析。结果显示:B7-H1 mRNA在白血病细胞系、原代急性白血病细胞中的表达水平较低,在IFN-γ体外诱导后的白血病细胞系、原代白血病细胞诱导生成的DC中的表达水平明显上调,在化疗后未获完全缓解(CR)的患者白血病细胞中B7-H1 mRNA表达水平明显高于化疗后获得CR的患者。结论:B7-H1基因在白血病细胞中的表达水平较低,但在某些因素作用下其表达水平明显上调。白血病细胞中B7-H1基因表达水平与患者的治疗反应有显著相关性。     

变异I κ B α抑制肝癌细胞株HCC9204中NF-κ B的活性及侵袭转移

目的探讨重组腺病毒变异IκBα(mIκBα)对HCC9204中NF-κB活性和转移相关能力的影响。方法利用有限稀释法测定病毒滴度,扩增AdmIκBα的滴度为1.252×109pfu/mL,以MOI 20、35、50的AdIκBαm感染HCC9204细胞;Western印迹检测细胞NF-κB(p65)的表达,EMSA法检测NF-κB的活性;以细胞粘附人工重组基底膜实验检测HCC9204细胞的粘附能力;用Transwell小室法检测HCC9204的侵袭和运动能力。结果MOI=20时,NF-κB的活性、P65蛋白表达开始下降,在MOI=50时降低到最低水平,AdIκBαm对NF-κB表达的抑制呈剂量依赖性,并且HCC9204细胞的细胞黏附、运动和侵袭转移能力逐渐降低。结论重组腺病毒变异IκBa抑制HCC9204中NF-κB的活性及体外细胞的浸润转移能力。     

糖皮质激素受体α基因转染在创伤组织修复过程中的意义

目的:体外观察糖皮质激素受体α(GRα)基因转染对核转录因子κB(NF-κB)活化及转录活性的调控作用,探讨GR促进创伤组织修复的作用机制。方法:采用体外培养内皮细胞株(ECV-304),脂质体法转染GRα基因,24h后用转化生长因子(TNFα)刺激细胞并收集不同时相细胞,提取核蛋白,凝胶电泳迁移率改变分析法检测NF-κB的核转位活化;同时观测GRα基因转染对NF-κB报告基因表达的影响。结果:与单纯TNFα刺激组相比,GRα基因转染能显著抑制TNFα刺激后细胞NF-κB的活化。GRα基因转染可抑制NF-κB报告基因的表达。结论:糖皮质激素受体α基因转染能抑制NF-κB的活化及转录调控作用,提示GRα基因转染有利于创伤组织的修复。     

不同羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞原代培养研究

目的观察完整羊膜与去上皮羊膜两种不同载体上所培养的人角膜缘上皮细胞的生长特点及P63的表达情况。方法采用组织块培养法体外扩增培养人角膜缘上皮细胞,将来自同一供体的2块角膜缘组织随机种植于完整上皮羊膜(A组)和去上皮羊膜(B组)上培养。倒置显微镜下观察培养细胞体外生长的形态及特点,并运用免疫细胞化学方法观察所培养的细胞P63抗体的表达情况。结果 A、B两组细胞(每组10例)分别培养成功8例。两组培养成功的8例细胞均能在体外移行、扩增、连接成片。B组移行扩增的速度较A组快。两组细胞生长至14 d时做免疫细胞化学染色,共16孔细胞中均可见P63阳性细胞,其中A组细胞P63阳性率高于B组细胞(P<0.05)。结论角膜缘上皮细胞在完整羊膜和去上皮羊膜上均能体外扩增,去上皮羊膜为载体的角膜缘上皮细胞增殖分化快,完整羊膜为载体的细胞P63阳性率高于去上皮羊膜为载体的细胞。     

S1通过调节糖代谢途径抑制黑色素瘤B16细胞生长作用的体内外研究

目的通过体内外实验研究探讨BH3-only模拟物S1抑制小鼠黑色素瘤B16细胞生长的机制。方法体外实验分为对照组、S1组(5μmol/L),MTT法检测细胞存活率;Hoechst 33342染色法检测细胞核形态变化;生化试剂盒检测细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量。体内实验将B16细胞种植于BALB/C小鼠腋下,14天后腹腔注射S1(0.6mg/kg),隔天给药,共计28天。实验分为对照组、S1组。免疫组化法检测移植瘤糖代谢相关蛋白HK2、PKM2的表达变化。结果与对照组相比,S1组B16细胞生存率明显降低,差异有统计学意义(P0.05);凋亡核明显增多;葡萄糖摄取减少,乳酸分泌减少。与对照组相比,S1组移植瘤中HK2、PKM2蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论S1在体内和体外均可抑制小鼠黑色素瘤B16细胞生长,可能是通过抑制葡萄糖代谢诱导细胞凋亡发挥抑瘤作用。     

兔关节软骨接受体外冲击波治疗后细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景：关节软骨损伤后自身修复能力有限,体外冲击波可能提供一种高质量的修复关节软骨损伤并达到很好远期疗效的方法。目的：探讨体外冲击波对兔关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白表达的影响。方法：酶消化法获得正常兔膝关节软骨细胞,培养并传代,实验A、B、C组分别用0.5×105,1.5×105,2.5×105Pa等3种强度能量体外冲击波干预,空白对照组无任何干预措施。结果与结论：细胞生长曲线在第6天实验B组显著高于其他各组（P〈0.05）;ELISA法检测实验B组Ⅱ型胶原A值与其他各组相比,显著升高（P〈0.05）;RT-PCR法检测实验B组Ⅱ型胶原表达明显增强,与其他各组相比差异有显著性意义（P〈0.05）。提示适当能量强度及频次的体外冲击波刺激,能够明显促进软骨细胞的增殖及Ⅱ型胶原表达。     

ATP5B蛋白在乳腺癌中的表达及对其功能的初步探究

目的探究人体乳腺癌组织中ATP5B蛋白的表达情况,分析ATP5B蛋白的表达与乳腺癌患者临床病理参数的相关性。初步探究ATP5B蛋白对乳腺癌细胞生物学功能的影响。方法收集本院乳腺癌组织及相应癌旁乳腺组织标本各30例,免疫组化检测其ATP5B蛋白的表达,分析在癌组织与癌旁乳腺组织中表达的差异性;统计分析乳腺癌组织ATP5B蛋白的表达与临床病理参数ER、PR、Ki-67、HER2及淋巴结转移的相关性。构建ATP5B siRNA质粒,在体外沉默乳腺癌细胞ATP5B蛋白的表达,通过细胞划痕实验、Transwell迁移实验、MTT法探究ATP5B对乳腺癌细胞生物学功能的影响。结果ATP5B蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁乳腺组织(P0.05);乳腺癌组织中ATP5B蛋白表达的高低与乳腺癌患者的临床病理参数ER、PR、Ki-67、HER2及淋巴结转移无明显相关性(P0.05);在体外沉默ATP5B蛋白的表达,可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖活性及迁移能力。结论乳腺癌细胞中ATP5B起着促癌基因的作用,其高表达可以促进乳腺癌细胞的增殖及迁移。     

雷公藤内酯醇对神经胶质瘤U87细胞侵袭性抑制的体外研究

目的 研究雷公藤内酯醇（triptolide）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭性的抑制作用,并探讨其作用分子机制. 方法 使用MTT法检测雷公藤内酯醇对胶质瘤U87细胞增殖抑制作用, Transwell实验检测雷公藤内酯醇处理后细胞侵袭能力的变化,进一步通过Real-Time PCR和Western印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的组织蛋白酶B（Cathepsins B,CB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响. 结果 雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制胶质瘤细胞增殖,同时可减弱U87胶质瘤细胞的侵袭能力,下调其CB、MMP-9表达水平. 结论 在体外实验中雷公藤内酯醇抑制U87胶质瘤细胞侵袭性生长的机制与下调CB及MMP-9的表达,降低胶质瘤细胞水解细胞外基质的能力有关.     

CD40激发对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响

目的 观察重组人可溶性CD40配体（rhsCD40L)及CD40L基因转染细胞（CD40L-TC）对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响，探讨rhsCD40L在肿瘤生物治疗中的可能作用。方法 利用基因工程技术获得了rhsCD40L和CD40L-TC，分别与恶性B淋巴细胞株XG2，XG7，U266，8226，Raji及Daudi共同作用，分析了CD40激发对肿瘤细胞的体外增殖（锥虫蓝计数法），细胞周期（碘化丙锭掺入法），细胞表面共刺激分子的表达（免疫荧光标记法）以及细胞凋亡（Anexin-V-ETTC法）的效应。结果 （1）恶性B淋巴细胞株CD40表达呈异质性，XG2高表达CD40，8266，Raji和Daudi中度表达，而XG7和U266不表达CD40。显微镜下观察发现，rhsCD40L(5μg/ml）可引起XG2或Daudi细胞的同型聚集，该效应在作用6-8h后即可出现；与CD40L-TC细胞共育后（肿瘤细胞；CD40L-TC=5：1），XG2，Raji和Daudi细胞可粘附于CD40L-TC表面；（2）rhsCD40L和CD40L-TC均可显著抑制XG2，Raji和Daudi细胞的体外增殖，导致XG2细胞呈现G1期阻滞，而Raji和Daudi细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞11.6%和8.9%,Daudi14.2%和15.9%;(3)表型分析显示；rhsCD40L/CD40L-TC可明显上调XG2,Raji和Daudi细胞CD95的表达水平以及Raji细胞CD80的表达，而下调Raji细胞CD18的表达。结论 rhsCD40L能直接并显著地抑制恶性B淋巴瘤细胞株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激分子CD80的表达，具有膜型CD40L的同样生物学功能，故rhsCD40L具有潜在的抗恶性B淋巴细胞肿瘤的作用。     

小鼠恶性黑色素瘤MCP-1趋化型肿瘤疫苗的研究

目的构建MCP-1的真核表达载体,并转染小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16,从而构建含有趋化因子MCP-1的小鼠恶性黑色素瘤疫苗,研究该疫苗在体外对淋巴细胞的趋化作用。方法通过对目的基因的提取来构建重组质粒p EGFP-N1-MCP-1并转染裸鼠恶性黑色素瘤细胞株B16,观察其对单个核细胞体外趋化的活性。结果趋化型肿瘤细胞疫苗B16-MCP-1组细胞侵袭数目明显高于空白培养基阴性对照组及野生型B16疫苗组,而野生型B16疫苗组趋化的单个核细胞数目与阴性对照组相似。结论成功构建MCP-1真核表达载体p EGFP-N1-MCP-1及小鼠趋化型肿瘤疫苗B16-MCP-1,该疫苗在体外具有趋化小鼠单个核细胞的功能。     

不同葡萄糖浓度对大鼠睾丸Sertoli细胞功能的影响

目的:研究不同葡萄糖浓度对体外培养的Sertoli细胞分泌ABP量和抑制素B(INHB) mRNA表达量的影响,进一步探讨高糖环境对大鼠睾丸Sertoli细胞功能影响.方法:建立不同葡萄糖浓度(5.6 ～ 40mmol/L)的Sertoli细胞体外培养模型,ELISA方法测量各组细胞培养液中的ABP含量及RT-PCR方法检测Sertoli细胞抑制素B mRNA的相对表达量并进行比较.结果:当培养基葡萄糖浓度在5.6～20.6 mmol/L时,Sertoli细胞分泌ABP量随葡萄糖浓度增加而增加,但当浓度超过此范围时,ABP的分泌量明显下降,而INHB mRNA表达量与培养基葡萄糖浓度呈负相关.结论:高糖环境对体外培养的大鼠睾丸Sertoli细胞的合成及分泌功能有明显影响.     

PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235对弥漫大B细胞株靶向作用的体外研究

目的:在体外水平研究新型PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235对弥漫大B细胞株的靶向作用机制。方法:采用CCK-8法检测NVP-BEZ235对弥漫大B细胞株SUDHL-4和DB细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,蛋白印迹法检测靶蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号转导通路上下游分子、细胞周期及凋亡相关分子的变化。结果:NVP-BEZ235可呈剂量依赖性地抑制弥漫大B细胞株SUDHL-4和DB的增殖;使细胞周期阻滞在G0/G1期,并促进细胞凋亡;蛋白印迹检测显示NVP-BEZ235能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键分子的活性,下调细胞周期相关蛋白,上调凋亡相关蛋白。结论:PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235可在体外水平抑制弥漫大B细胞株SUDHL-4和DB的生长,使细胞周期阻滞在G0/G1期,促进细胞凋亡。     

小鼠脾脏B淋巴细胞纯化培养方法的建立

背景:B淋巴细胞是机体免疫系统重要的参与者,目前的研究主要采用磁珠、补体等方法进行B淋巴细胞的分离纯化,但是这些方法费用高或者细胞损伤大、纯度低,体外分离、培养B淋巴细胞的方法还有待进一步改进。目的:探讨从小鼠脾脏细胞中对B淋巴细胞同时进行分离、培养的方法。采用加入白细胞介素4、脂多糖或者CD3单克隆抗体及其组合,探讨体外分离、培养小鼠脾脏B淋巴细胞的适宜条件。方法:体外分离培养小鼠脾脏细胞,随机分为7组,分别用白细胞介素4,CD3,脂多糖,白细胞介素4+CD3,白细胞介素4+脂多糖,CD3+脂多糖组进行干预、将未给予刺激的脾细胞作为对照组。用流式细胞仪检测在不同培养条件下小鼠脾脏细胞T、B淋巴细胞及其亚群的变化。结果与结论:与对照组比较,白细胞介素4组淋巴细胞在培养后第3-5天数量达到高峰;脂多糖组在培养初期无明显作用,第3天开始淋巴细胞数量有明显的增加,第5天达到高峰;培养体系中加入CD3单克隆抗体,可导致T淋巴细胞消失,培养2 d后,可得到较为单一的B淋巴细胞,其细胞数量在第3天达到高峰。其中B220+IgD+成熟B淋巴细胞亚群数量显著增加。体外培养24 h后,各组B220+CD93+Transitional B淋巴细胞亚群均完全消失。结果说明,体外培养的小鼠脾脏细胞加入CD3单克隆抗体和白细胞介素4可以去除T淋巴细胞,并维持成熟B淋巴细胞的生存和增殖。     

利用猪子宫三种体外培养细胞构建三维医学模型

目的 在体外培养出结构和功能与活体组织和器官相同或相似的结构功能体,以作为器官移植宝贵材料或其他生物现象的体外研究模型.方法 运用胰蛋白酶消化、细胞筛网法和组织块贴壁法分离构建三维医学模型所需的种子细胞,然后选择适宜的生物支架材料,最后将种子细胞依照自然子宫结构附植在支架材料上,经体外培养而获得的与自然子宫形态与功能相似的模拟体.结果 本实验成功地建立了上皮细胞、基质细胞和平滑肌细胞的有限细胞系,并构建了猪子宫三种体外培养细胞三维医学模型.结论 运用胰蛋白酶消化、细胞筛网法和组织块贴壁法分离种子细胞是一种较好的方法,其分离结果细胞较纯.     

自体调节性T细胞可抑制恶性淋巴瘤细胞的增殖

本研究探讨自体调节性T细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EIA的作用及其机制。应用免疫磁珠分离法（MACS）分选获得C57BL／6小鼠CD4＋CD25＋T细胞（Treg细胞）,流式细胞术检测细胞纯度及Foxp3表达情况,MTY比色法检测分选的Treg细胞对T细胞淋巴瘤细胞系EL4的体外抑制作用,应用ELISA方法检测TGF—B1和IL-10的含量。结果表明：MACS分选获得CIM＋CD25＋T细胞纯度达91．6％,活细胞比例〉95％,Foxp3表达率为78．9％。MTT比色法证实自体Treg细胞在体外能够明显抑制EIA细胞的增殖（P〈0．05）,且呈细胞因子非依赖性。作者首次证明,自体Treg细胞体外有明显抑制T细胞淋巴瘤细胞系EIA增殖的作用。