Wipe Test在HLA组织配型实验室污染监测及预防管理中的应用

目的建立人类白细胞抗原(HLA)组织配型实验室常规DNA污染监测试验体系,预防和消除可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染。方法设计含多种阴阳性对照和各关键监测点的完整反应链,针对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因扩增区域内的非多态区进行引物特异性PCR,琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物;对被污染监测点进行局部灭活处理后对相应监测点重新采样进行灭活验证;同时采取不定期抽查监测与定期全面监测相结合的方式确保实验过程零污染。结果灭活处理及整改后,所监测HLA基因分型实验过程中的核酸抽提区、PCR加样区、PCR扩增区、下游产物处理区4个区域的主要监测点污染监测结果均合格。结论该研究建立的以Wipe Test为核心的DNA防污染监测实验体系能够有效监测和灭活验证可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染,是HLA组织配型实验室质量控制管理程序的重要组成部分。     

脊髓灰质炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法的应用与发展

正1996年美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR技术,该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1-2]。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,可动态实时检测核酸产物的形成,无需后处理过程,避免了扩增产物的污染,而且具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭和易操作等优点,因而目前已得到广泛应用[3-4]。     

TaqMan实时荧光PCR快速检测人HLA-B*27

目前,已有多种分子生物学技术被用于HLA-B * 27检测,如PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)和PCR-SSP等.但是这些方法都需要在PCR后进行凝胶电泳或杂交分析,不仅耗时,且易造成遗留污染与假阳性,还可能因使用强诱变剂溴乙锭为示踪剂,使其应用受到一定限制[1].TaqMan实时荧光PCR是20世纪90年代的新型核酸检测方法,其能实时监测PCR的荧光强度,同时进行扩增与检测,因而无需在PCR完成后进行凝胶电泳或杂交分析,不仅能有效避免遗留污染与假阳性,而且不用溴乙锭等强诱变剂[2-3].因此,其一出现即备受青睐,并被认为是基因分型、基因表达及基因突变检测的强有力工具.然而,目前尚鲜见TaqMan实时荧光PCR检测HLA-B*27的研究报道,本研究用其检测人HLA-B*27,以探讨其应用价值.     

基于标准曲线的两台PCR仪检测结果的可比性分析

目的 分析同一实验室2台实时荧光定量PCR仪标准曲线相关参数的可比性.方法 常规条件下,使用同一批号试剂,将HBV DNA检测标准品与待测标本、室内质控在2台实时荧光定量PCR仪上同时进行扩增,比较标准曲线的斜率、截距及Ct值,分析检测结果的一致性.结果 作为单一检测系统,相同批号标准品在同一批号检测试剂的多批次实验中,2台仪器均有良好重复性,2台实时荧光定量PCR仪之间的测定结果差异无统计学意义（P〉0.05）.结论 实验室存在多台实时荧光定量PCR仪时,可通过分析标准曲线的相关参数来监测不同仪器间检测结果的一致性,保证检测结果的准确可靠.     

预防PCR检测中的污染初探

作为一种新的检测技术，PCR具有其它传统方法无与伦比的优点：灵敏度高、特异性强、操作简便等。也存在着严重的不足，极微量的污染即可导致假阳性结果。因此，PCR污染问题已引起人们极大的关注，如何防止PCR污染已成为整个实验成功的关键，现就我院PCR实验室二年来采取的预防污染办法介绍如下：PCR检测过程中的污染来源有三：一是标本间的交叉污染；二是实验室中克隆质粒的污染；三是扩增产物的污染，其中以第三种为最主要，因此冠以“残留污染”（Carryover）。PCR污染可能来自标本处理过程中所伴随的阳性质粒，通过空气和气溶胶…     

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的　探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法　建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果　优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论　为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒（HBV）DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）是目前测定HBVDNA较为简便、敏感和特异的方法。影响实时荧光PCR准确定量的因素很多．我们在对血清HBVDNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则（以下称“异常扩增曲线”），致检测结果明显偏低，对此我们进行了分析。     

PCR试验加样过程中无DNA原则控制污染的探讨

目的　探究在PCR操作过程中如何预防污染的一些基本操作方法。方法　首先制定了PCR操作过程中的无DNA原则 ,对实验室的划分 ,操作总原则 ,Eppendorf管开、关 ,有螺旋的离心管开、关 ,装有反应体系Eppendorf管的放置 ,标记反应管的操作 ,移液器的使用方法等进行规范化 ,最大限度地避免DNA污染反应体系。然后通过扩增新鲜扁桃体组织中珠蛋白基因及模拟手套被质粒污染的情况下扩增质粒基因 ,验证该无DNA操作过程对避免污染的有效性。结果　按本实验的规范方法进行操作 ,所有阴性对照均未出现假阳性。结论　采用这种无DNA原则进行PCR操作 ,是控制反应体系污染的一种有效方法。     

通用TaqMan探针技术在apoE基因3937T/C单核苷酸多态性检测中的应用

目的　建立一种基于通用TaqMan探针技术的快速、准确且经济的实时荧光PCR方法 ,用于检测apoE基因第四外显子上的一个单核苷酸多态性 (SNP)位点 (3937T/C)。方法　应用PCR RFLP分型方法建立apoE 3937T/C多态性分析的参考样本 ,同时对部分样本进行PCR产物直接测序以验证PCR RFLP分型结果。选择一对能够有效区分 3937T/C多态性的等位基因特异的上游引物 ,配对进行通用TaqMan探针实时PCR扩增 ,然后通过比较两个平行反应达到阈值时所经历的循环数 (Ct)的大小 ,对apoE 3937T/C多态性进行区分。结果　建立的基于通用TaqMan探针技术的实时荧光PCR方法 ,用于apoE基因第四外显子上 3937T/CSNP分析 ,检测结果与PCR RFLP方法、DNA测序法结果完全一致。结论　在进行PCR扩增条件优化的前提下 ,应用通用TaqMan探针对PCR进行全程监测是可行而且是非常经济的 ;基于通用TaqMan探针技术的等位基因特异的实时荧光PCR方法敏感、简单、快速 ,可实现对apoE基因 3937T/C单核苷酸多态性的快速检测 ,而且在其他的SNP位点高通量分析中具有潜在的应用价值     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒(HBV)DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是目前测定HBV DNA较为简便、敏感和特异的方法[1].影响实时荧光PCR准确定量的因素很多,我们在对血清HBV DNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则(以下称"异常扩增曲线"),致检测结果明显偏低,对此我们进行了分析.     

PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，本文就PCR污染的原因及其监测、防止的方法提出探讨     

真菌PCR中的污染问题

近年来从临床标本中扩增真菌DNA的技术已经成功地建立。有五个欧州的研究机构,联合对真菌PCR中由气溶胶和试剂携带污染的危险性和频度作了分析。发现在150次PCR实验中有12次,共2800价标本被真菌污染（3．3％的阴性对照在提取DNA时被污染;4．7％在PCR扩增过程中被污染）,其污染的真菌种类有：烟曲霉菌、酿酒酵母菌以及支顶孢属菌。进一步分析表明,像酵解酶粉或10倍浓缩的缓衡液等市售产品中,可能也含有真菌DNA。总之,如果注意操作,真菌PCR中的污染危险性并不会比其他PCR诊断更高的。真菌PCR中的污染问题…     

实时定量PCR检测血液恶性肿瘤的微小残留病

实时定量PCR(RQ-PCR)是近年出现的一种新的核酸定量技术,将常规PCR与探针杂交技术融为一体.在PCR反应体系中加入荧光探针,该探针与靶DNA/cDNA特异性结合.PCR反应延伸阶段,Taq酶发挥其5'→3'外切酶活性将荧光探针切断,荧光信号得以释放,荧光信号强度与PCR产物成正比.因此,通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,可以在一个密闭体系中对待测标本进行精确定量分析.RQ-PCR成功地解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染而导致假阳性、需进行PCR后处理等问题,为检测血液系肿瘤微小残留病提供了快速、简便、精确、敏感、可靠的工具.本文阐述了RQ-PCR的基本原理以及在血液系统恶性肿瘤,如急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和恶性淋巴瘤微小残留病检测中的应用.     

影响HBV DNA测定的标本因素

乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的定量测定在乙型肝炎病人的临床用药、治疗监测及判断预后方面具有重要的意义.目前,HBV DNA的测定方法主要是用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),该方法具有实时监测,操作简单,定量范围宽,结果重复性好等优点,被全国许多医院的临床实验室接受.但因FQ-PCR敏感性高,卫生部临检中心对方法中的各个环节制定了规范性的要求,以消除除PCR本身外的外界影响因素.本研究主要通过对测定标本溶血、黄疸、脂血对PCR反应的影响,探讨实验中这些因素的干扰究竟有多大,为规范送检标本要求提供依据,对无法消除这些性状的标本的实验结果进行客观的判断分析.     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

建立实时荧光LAMP法检测肺炎支原体

目的建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为10~3 copies/μL,当基因拷贝数大于10~4 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为10~4 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

聚合酶链反应中污染环节的分析

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,该技术通过重复94℃～95℃变性、37℃～55℃复性、72℃延伸等简单的3个温度,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性,操作者稍不注意就会造成污染,极微量的污染便可导致假阳性结果,现分别对污染和如何判断污染及污染源的追踪等3个部分进行阐述。1污染为了使读者重视操作堆积化及其重要性,我们将PCR整体绘制成PCR污染示意图,并分别叙述各区的相互关系,图中分为4个区,即污染1区、清洁区、污染2区、交叉污染区等。见图1。     

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。     

实时荧光定量PCR技术的优化及其在恙虫病东方体诊断中的应用

目的建立一种优化的实时荧光定量PCR技术,并用于诊断粤北山区恙虫病东方体(Ot)基因型。方法采用优化实时荧光定量PCR技术对感染Ot的患者和鼠类的血液和组织标本检测Ot DNA载量并分析其基因型,并与未优化实时荧光定量PCR和巢式PCR的检测结果进行比较。结果采用优化实时荧光定量PCR技术检测660例发热患者,有224例检测到Ot,其中108例是发热5d内的早期患恙虫病患者,以及在55份鼠类的标本中有12份能检测到感染Ot,均为Gilliam型;未优化实时荧光定量PCR在患病7d以上才能检测到Ot。同时,在鼠类基因扩增片段还显示出与Gilliam、Karp、Kato3株国际参考株不同,经巢式PCR分型证实为Kawasaki型,与巢式PCR基因分型的结果相符。结论优化实时荧光定量PCR技术可作为早期诊断恙虫病的实验方法,用于快速分析Ot基因型,适合在基层医院推广应用。     

广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌的检测

目的 了解广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌污染的状况。 方法 于2010年7—8月共采集江门市3家农贸市场6个不同品种的淡水产品共计161份进行检测,检样接种改良头孢派酮MacConkey琼脂(CMA)平板培养分离可疑菌株,经革兰染色、生化实验、特异性片段 PCR 扩增进行香港海鸥菌的鉴定,并选取5株进行了16S rRNA 基因序列测定和比对分析。 结果 161份检样中共检出香港海鸥菌20株,总阳性率为8.05% (20/161), 其中香港海鸥菌在草鱼的阳性率为30.1%(19/63),5只虎纹蛙中检出1只阳性。 结论 江门市淡水产品中存在香港海鸥菌的污染,草鱼和蛙类可能是污染的重要来源,应加强监测和预警。