斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的 在我们的前期研究工作中，通过Tol2转座子介导的插入突变，筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2：20141221t的GFP在神经系统中表达，但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置，造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法 使用交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）鉴定Tol2转座子插入的基因组位置；利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性；筛选鉴定纯合体突变体，并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果 在该品系中，Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a，sat1.a）的第八个内含子区域，致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体，但是没有检测到明显的发育缺陷。结论 筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷，但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

Kruppel样因子6对肝癌HepG2细胞的作用及其缺失对斑马鱼肝脏发育的影响

目的 探讨Kruppel样因子6（KLF6）低表达对肝癌细胞凋亡及迁移能力的影响,并以斑马鱼作为动物模型,研究klf6基因沉默对肝脏发育的作用。方法 构建敲除KLF6基因质粒,转染肝癌细胞（HepG2）及正常人肝细胞（L-02）,通过免疫印迹（WB）、凋亡及细胞周期测定、划痕实验检测KLF6基因敲除后对HepG2细胞的影响;设计合成沉默KLF6基因的吗啉代寡核苷酸（Morpholino）,显微注射入转基因斑马鱼Tg（lfabp：eGFP）胚胎中,通过免疫荧光法观察KLF6蛋白表达的变化以及对转基因斑马鱼胚胎肝脏发育表型的影响。结果 体外实验表明,L-02细胞中的KLF6蛋白的表达量明显高于HepG2细胞;敲除KLF6基因后,HepG2细胞KLF6蛋白表达明显减少、凋亡减弱、细胞周期主要集中于S期、迁移能力增强;体内实验表明,klf6基因沉默后,斑马鱼胚胎肝脏中的KLF6蛋白表达量减少,肝脏发育明显迟缓。结论 KLF6基因低表达促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,减少凋亡;且影响斑马鱼肝脏的正常发育。探讨KLF6基因低表达及其功能,可为以后斑马鱼肝癌模型建立及药物筛选提供理论基础。     

IL-6基因多态性与帕金森病预后的关系

目的 探讨IL-6基因rs1800796多态性与帕金森病预后的关系。方法 收集2017年1月—2019年12月聊城市人民医院就诊的帕金森病患者80例作为帕金森病组;同期收集该院体检的健康志愿者50例作为对照组。检测患者IL-6基因C-572G位点（rs1800796）的多态性,比较两组研究对象基因型频率和等位基因频率的差异,分析IL-6不同基因型帕金森患者经美多巴治疗后的疗效差异。结果 帕金森病组IL-6基因C-572G位点（rs1800796）CC野生型和等位基因C频率低于对照组（均P <0.05）,而GG纯合型和等位基因G频率高于对照组（均P <0.05）。美多芭治疗前、后UPDRS、PDQ-39、MMSE和MoCA评分CC型最低,CG型次之,而GG型最高（P <0.05）。结论 IL-6基因C-572G位点（rs1800796）多态性与帕金森病预后均存在密切的关系,发生鸟嘌呤核苷酸（G）突变患者具有更为严重的病情。     

利用CRISPER/Cas9技术构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠

目的：通过 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术构建卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase， LCAT）基因敲入C57BL/6小鼠并与肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠配繁得到肝脏特异性敲入Lcat基因C57BL/6小鼠模型。 为Lcat基因在肝脏相关代谢疾病发生机制的研究提供动物模型。方法：利用CRISPR/Cas9技术构建Lcat基因敲入小鼠；利用肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠与Lcat基因敲入小鼠交配得到肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠；通过PCR法鉴定小鼠的基因型 ；利用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和 Western blot 技术验证 Lcat 基因的 mRNA 水平和蛋白水平。 结果：PCR结果显示肝脏特异性敲入Lcat基因的小鼠模型构建成功；qPCR结果显示Lcat基因在肝脏中特异性高表达；WB结果显示，与对照组小鼠相比，LCAT蛋白在肝脏特异性敲入Lcat的小鼠肝脏中有明显更高的表达。结论：成功构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠，为在动物水平探索Lcat基因在肝脏相关代谢疾病中的功能及相关发病机制提供研究平台。     

转双价抗虫基因 Bt-CpTI 提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 CryIA(c) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 CpTI 共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法 构建了以 CaMV 35S 为启动子,新霉素磷酸转移酶 (Npt-Ⅱ) 为选择标记,带有 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因的植物表达载体 pGBI121S4ABC 并转入根癌农杆菌 LBA4404。采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测,并进行抗小菜蛾实验。结果 T₀ 代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到 16.67%。Southern 杂交检测结果表明外源 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论 转双价抗虫基因 Bt-CpTI 是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

棕背鼠平性别的快速鉴定

目的 野生棕背鼠平因其活动敏捷?性情凶猛?不易抓取,很难从外表对其性别做出准确判断,影响分笼及后期的实验室繁育,拟建立一种快速?准确?简便的性别鉴定方法?方法 以棕背鼠平的新鲜被毛为材料,Chelex?100 提取毛囊DNA,利用PCR 技术分别扩增锌指结构基因(ZFY/ZFY)片段和Y 染色体性别决定区基因(SRY)片段,并建立双重PCR 扩增方法?结果 雄性棕背鼠平扩增出ZFY/ZFY和SRY 两个基因片段,而雌性棕背鼠平只扩增出ZFY/ZFY基因片段?利用这种方法对23 只棕背鼠平?10 只Wistar 大鼠和8 只BALB/ c 小鼠进行性别鉴定,扩增结果与表型判断和解剖结果一致?结论 以被毛为实验材料,减少了对棕背鼠平的惊吓和损伤;建立的双重PCR 扩增方法准确?快速,可应用于鼠的性别鉴定?     

翻白草的化学成分研究

目的 研究翻白草Potentilla discolor的化学成分。方法 采用70%乙醇提取,利用硅胶、反相（ODS）、凝胶等柱色谱及制备液相色谱进行分离,并根据理化性质和光谱数据鉴定化合物结构。结果 从翻白草中分离得到10个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇（1）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（2）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、8-甲氧基草质素-3-O-β-D-槐糖苷（4）、芦丁（5）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（6）、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（7）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（8）、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷（9）、短叶苏木酚酸（10）。结论 化合物4、7为首次从该属植物中得到,化合物4、7、9、10为首次从该种植物中得到。     

伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病患者临床表型与NOTCH3基因型的关系

目的 探讨伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）患者NOTCH3基因不同外显子突变与临床表型间的关联。方法 以2015年5月至2017年12月于上海交通大学医学院附属第九人民医院就诊的有临床症状的15个家系30例CADASIL患者作为研究对象,采集患者详细临床资料和基因分析结果,并对患者NOTCH3基因不同外显子突变与发病年龄、首发临床症状、症状性缺血性脑卒中发作次数等临床表型间的关系进行分析。结果 15个家系中共检出NOTCH3基因不同突变位点12个,其中7个位于4号外显子,3个位于11号外显子,另外2个分别位于19号和20号外显子。11号外显子突变的患者发病年龄最晚[（53.6±13.3）岁,n=7],其次为4号外显子突变的患者[（42.7±5.7）岁,n=15],而其他外显子（19号和20号）突变的患者发病年龄[（33.5±7.5）岁,n=8]均早于4号和11号外显子突变的患者（P<0.01,P<0.05）。4号外显子突变的患者以运动、语言障碍起病占多数（11/15,73.3%）,而19号、20号外显子突变的患者以认知障碍起病多见（7/8,87.5%）。4号外显子突变的患者症状性缺血性脑卒中发作次数中位数为3次,11号外显子突变的患者为2次,而19号、20号外显子突变的患者均未发生症状性缺血性脑卒中。结论 在CADASIL患者中,NOTCH3基因4号和11号外显子为突变热点,不同外显子突变与发病年龄、发病症状和症状性缺血性脑卒中的发生之间存在一定关联。     

阿霉素对模式生物斑马鱼中abcb4基因表达的影响

目的 选择斑马鱼作为实验对象,研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对其abcb4基因表达的影响,进一步了解abcb4基因在斑马鱼多药耐药机制中可能的作用。方法 分别以2 mL/L二甲基亚砜（DMSO）,10 μmol/L DOX及含2 mL/L DMSO的10 μmol/L DOX对斑马鱼胚胎进行药物处理,另以Eggwater处理的胚胎作为对照组。将正常发育的4~16个细胞期斑马鱼胚胎,随机分入以上各组中,药物处理至120 hpf。收集药物处理下的斑马鱼不同时期胚胎运用实时荧光定量PCR和胚胎原位杂交技术,检测abcb4基因在斑马鱼中的表达变化情况。结果 相较于对照组,药物处理的斑马鱼胚胎abcb4基因mRNA表达水平升高(P<0.05),而abcb5基因mRNA表达情况则无明显变化。通过斑马鱼胚胎原位杂交,均在斑马鱼120 hpf胚胎小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且药物处理的斑马鱼胚胎在脑及心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论 DOX能诱导斑马鱼胚胎abcb4基因表达水平增高,对阐明abcb4基因在斑马鱼多药耐药产生机制中的作用具有重要意义。     

利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎lmna基因的初步研究

目的利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼lmna基因的技术方法。方法在斑马鱼lmna基因序列中选择靶点,设计针对斑马鱼lmna基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),构建能特异指示lmna基因表达的lmna-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中,通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应lmna基因表达量,并通过蛋白质印迹法检测胚胎中lamin蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内lamin蛋白的表达,分别有大小为69 KD和62 KD两种蛋白表达。设计并构建了lmna-MO和重组质粒lmnaEGFP-pCS~(2+),单独注射lmna-EGFP-pCS~(2+)质粒后观察到从6 hpf到96 hpf胚胎均有绿色荧光蛋白表达;二者共注射后观察到,与对照组相比,实验组从6 hpf至30 hpf胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失;蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内lamin蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎lmna基因表达。结论可通过lmna-MO和重组质粒lmna-EGFP-pCS~(2+)共注射方法下调斑马鱼lmna基因表达,并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。     

P-选择素缺失对小鼠生理特征的影响

目的 探讨P-选择素基因（P-selectin）缺失对小鼠生理特征的影响。方法 P-选择素敲除（PKO）小鼠和C57小鼠饲养于SPF级环境中,通过基因鉴定确定其为纯和PKO小鼠。观察PKO小鼠的活动状态、繁育状况,检测血常规,确定P-选择素敲除后对小鼠一般情况的影响。分别于6周和18周处死小鼠,通过伊红&苏木素（HE）染色,观察P-选择素敲除后对小鼠各个脏器组织结构的影响。结果 PKO小鼠与正常C57小鼠的繁育状况相似,血常规无异常,HE染色发现PKO小鼠肝、脾、肺、肾组织结构均较正常。结论 P-选择素的缺失不会对小鼠生殖繁育、血液造成影响,对重要的组织脏器也未见明显影响,为以后进一步研究P-选择素在疾病中的作用提供了动物模型研究理论基础。     

苍耳化学成分的分离与鉴定

目的 对苍耳Xanthium sibiricum地上部分的化学成分进行分离和鉴定。方法 采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱、MCI凝胶色谱和Sephadex LH-20柱色谱等方法对其化学成分进行分离纯化,应用现代波谱技术ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR对化合物的结构进行鉴定。结果 从苍耳中分离得到了7个倍半萜类化合物,分别为苍耳农（1）、苍耳亭（2）、3-cycloheptene-1-acetic acid（3）、xanthinosin（4）、inusoniolide（5）、5-azuleneacetic acid（6）、2-hydroxy xanthinosin（7）。结论 化合物1为新化合物,命名为苍耳农,化合物3、6、7为首次从苍耳植物中分离,化合物5为首次从苍耳属植物中分离,其中化合物2的量较丰富（0.1%）,为开发新型植物源杀菌剂奠定了基础。     

刘寄奴化学成分研究

目的 研究刘寄奴Artemisia anomala的化学成分。方法 采用溶剂法和多种柱色谱法进行分离纯化,并经波谱分析鉴定化合物的结构。结果 从刘寄奴95%乙醇提取物的醋酸乙酯部位分离得到7个化合物,分别鉴定为 (4aS, 7S, 7aR)-7-羟基-7-甲基-1, 4a, 5, 6, 7, 7a-六氢环戊二烯 [c] 吡喃-4-羧酸甲酯（1）、rehmaglutin D（2）、(E)-6-羟基-2, 6-二甲基辛-2, 7-二烯酸（3）、金圣草酚（4）、木犀草素（5）、芹菜素（6）、对羟基苯丙烯酸（7）。结论 其中化合物1为新的环烯醚萜,命名为刘寄奴醚萜;化合物2为首次从该属植物中分离得到,化合物3、4和7为首次从该植物中分离得到。     

幽门螺杆菌毒力基因与克拉霉素耐药基因突变相关性

目的 分析浙江省台州地区幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）cagA和VacA为主的毒力基因型分布,探讨其与克拉霉素耐药基因突变类型的关系。方法 招募存在上消化道症状患者,并行胃镜检查活检患者胃黏膜组织。通过Hp分离培养方法,培养出216株Hp。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测并分析cagA和VacA的分型情况。采用PCR扩增和Sanger测序技术检测克拉霉素耐药基因（23S rRNA）2142和2143位碱基点突变情况。结果 CagA基因的阳性检出率为99.54%（215/216）,其中CagA-D为95.83%（207/216）、CagA-C为3.70%（8/216）。VacA基因阳性检出率为97.22%（210/216）,s1、s2、m1、m2亚型分别为97.22%（210/216）、0、35.19%（76/216）、60.65%（131/216）。本研究发现,浙江省台州地区毒力基因以CagA-D和VacAs1 m2型为优势基因型。此外,23S rRNA基因2142和2143位点均未突变的有93株。突变的有123株,其中A2142G位点突变4株、A2143G位点突变119株。毒力基因型与23S rRNA基因2142和2143位点突变类型无相关性（P>0.05）。结论 台州地区为HP高毒力地区,且以CagA-D和VacAs1 m2型为主,其分布与克拉霉素耐药基因突变无密切相关性。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

红树林底泥放线菌（N2010-37）抗肿瘤化学成分研究（I）

目的 寻找发现红树林底泥放线菌（N2010-37）中抗肿瘤活性成分。方法 放线菌（N2010-37）发酵菌丝体经95%乙醇提取,溶剂分级萃取,应用多种柱色谱分离和谱学分析方法对醋酸乙酯萃取部位化学成分进行分离鉴定。结果 从醋酸乙酯部位分离得到1个新的单环内酯和2个蒽酮类化合物,依次鉴定为 (3S, 4R, 7R, 8R, 9S)-3, 8-二羟基-4, 7, 9-三甲基-2, 6-环壬二酯（1）、1-甲氧基-2-羟基-3-甲基蒽醌（2）、1, 6, 8-三羟基-3-甲基蒽醌（3）。结论 化合物1为新化合物,体外抗肿瘤实验表明,化合物1和3对人类慢性髓性白血病细胞系K562细胞株具有一定的细胞毒活性。