白细胞介素12提高HBV基因疫苗的免疫应答

目的观察编码IL-12的真核表达载体对HBV基因疫苗诱导Babl/c小鼠免疫应答的影响。方法肌肉注射基因疫苗pCR3.1-S及IL-12的真核表达载体pWRG3169,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h5iCr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。结果免疫8w后,pCR3.1-S及共注射IL-12真核表达载体组血清450nmA值分别为0.87±0.1及1.67±0.15。CTL细胞杀伤活性分别为50.5%±6.4%及73.3%±8.8%,两组差异显著,CTL细胞杀伤活性在抗CD4单克隆抗体处理脾细胞悬液后无明显改变,抗CD8单克隆抗体处理后明显降低。结论IL-12的真核表达载体能提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答,CTL细胞杀伤活性主要由CD8+执行。基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒pVAX-S2S的构建及DNA免疫

目的为探索更安全的乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒,并观察其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫应答情况.方法采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出乙肝表面抗原中蛋白(preS2+S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,酶切鉴定,按不同剂量一次性肌内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果酶切鉴定重组质粒pVAX-S2S为正向插入的阳性克隆.HBVDNA疫苗(pVAX-S2S)高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)三组剂量一次性免疫健康BALB/c小鼠,均能在2 w诱导抗-HBs产生,抗体效价随时间延长而增长.血清抗体水平比较,高剂量组(97.83±38.78)mU/ml较中剂量组(45.13±21.12)mU/ml、低剂量组(19.74±11.92)mU/ml差异均具显著性(P＜0.05),以后的4,8 w高、中剂量组间差别缩小,但两者较低剂量组差异均具显著性(P＜0.05)和非常显著性(P＜0.01).结论卡那霉素抗性的重组质粒pVAX-S2S能有效诱导正常小鼠产生体液免疫应答.     

IL-12对结构优化的HBV核心抗原DNA疫苗诱导免疫应答的影响

目的 探讨IL-12对一种结构优化的HBV核心抗原(HBcAg)DNA疫苗免疫效果的影响。方法 将小鼠IL-12基因插入结构优化的DKA疫苗pST-HBc，构成pST-HBc/IL12，将pST-HBc／IL12转染COS7细胞，ELISA检测培养上清中的HBcAg和小鼠IL-12。分别将pST-HBc／IL12和pST-HBc肌肉注射接种BALB／c小鼠，检测小鼠的体液和细胞免疫应答。结果 ELISA检测到培养上清液中的HBcAg和小鼠IL-12，pST-HBc／IL12诱导的抗-HBc总IgG阳转率和抗体水平不及pST-HBc，但其诱导的脾细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞反应均强于pST-HBc。结论 IL-12可进一步增强这种HBcAgDNA疫苗诱导的细胞免疫应答。     

Hepatitis B virus S gene enhances immune responses of a multiple-epitope DNA construct of hepatitis C virus in mice

Hepatitis C virus (HCV) is a major causative agent of acute and chronic hepatitis and mainlytransmitted by blood routes. It is estimated thatthere are 170 million HCV infected individualsworldwide, and so far, interferon γ(IFN γ) com bined with ribavirin treatment is a commonly ac cepted therapeutic strategy. However, only about40% of treated patients develop long term respons es[1]. The hypervariable region 1(HVR1) of theHCV E2 envelope protein is critically …     

双重表达乙肝病毒前S2抗原的重组质粒的疫苗效应

目的：乙肝病毒（HBV）的前S2抗原具有比S抗原更强的免疫原性，可以更有效地诱生特异性免疫应答。文中构建含有前S2抗原编码基因的3种重组质粒，观察接种后诱生特异性体液免疫应答的情况。方法：采用PCR技术扩增HBV的S2-S和S1-S2-S基因；同时串联拼接产生S2-S-S2片段。继而构建重组表达质粒pcDNA3．1／S2S、pcDNA3．1／S1S2S和pcDNA3．1／S2SS2。后者意在表达S抗原的同时，双重表达前S2抗原。然后将上述3种质粒分别以100μg肌肉接种BALB／c小鼠，于2、4周后各加强1次。初次接种后3、5、8和12周，分别采血检测小鼠的前S2抗体和抗-HBs。结果：初次接种后3周，S2SS2组小鼠血清的前S2抗体检出率为12．5％，低于S1S2S组（25％）和S2S组（37．5％）；但5周时则达到87．5％，并持续到12周，优于S1S2S组和S2S组；并且S2SS2组的前S2抗体滴度达到1：2000，高于S2S组（1：500）和S1S2S组（1：50）。不过，S2SS2组同期的抗-HBs检出率和抗-HBs滴度则低于S1S2S组和S2S组。结论：重组质粒pcDNA3．1／S2S-S2以串联拼接方式双重表达前S2抗原，能够诱生较高水平的特异性前S2抗体，但其诱生抗HBs的能力却明显降低，这是在设计改造基因疫苗时需要考虑的一个重要问题。     

乙肝疫苗增强细胞因子诱导的杀伤细胞对于转乙型肝炎病毒基因小鼠的治疗作用

目的 观察乙肝疫苗是否增强细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对于乙型肝炎病毒转基因小鼠(hepatitis B virus transgenic mice,HBV-Tg)的抗病毒作用.方法 给予HBV-Tg腹腔注射CIK细胞,皮下注射乙肝疫苗,用荧光定量PCR检测外周血中HBV DNA水平变化,流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群,并用HE染色观察肝脏的组织病理改变.结果 CIK细胞降低了HBV-Tg鼠外周血中病毒载量,血中CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞增多,乙肝疫苗和CIK细胞联合应用后,这种作用增强.结论 乙肝疫苗增强了CIK对于HBV-Tg小鼠的治疗作用,这种增强作用是否通过增加体内CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞,尤其是CD8~+细胞而实现,有待进一步研究.     

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达与DNA免疫研究

目的 研究我国发现的乙肝病毒S基因突变株(129Leu和145Arg)表达HBsAg及DNA免疫的特性. 方法 用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的2株变异S基因(其中"a"决定簇突变,分别为nt540A→T,aa129Gln→Leu和nt587G→A,aa145Gly→Arg)片段,置换已知核苷酸序列并可表达及复制的HBV1.2个拷贝全基因野毒株重组质粒p3.8Ⅱ的S基因.将重组质粒转染HepG2细胞,用Abbott试剂和24种单抗检测转染细胞培养上清中HBsAg的结合力.用重组质粒DNA肌肉免疫小鼠. 结果 129Leu变异株转染细胞上清对HBsAg酶联免疫反应检测的吸光度(A)值高于p3.8Ⅱ野毒株,而145Arg变异株的A值低于p3.8Ⅱ;用24种单抗测定的总趋势为129Leu表达的HBsAg 的S/C值高于p3.8Ⅱ,而145Arg的结果则低于p3.8Ⅱ.三者表达的HBeAg水平相似.用DNA免疫经129Leu诱生的抗-HBs水平低于野毒株p3.8Ⅱ,但略高于145Arg. 结论 129Leu变异株表达的HBsAg与HBs多抗及单抗的结合力较野毒株明显增高,但129Leu 变异株DNA免疫诱生的抗-HBs水平却低于野毒株p3.8Ⅱ.免疫原性低下可能有利于129Leu致持续性感染.     

乙型肝炎表面抗原-破伤风类毒素结合疫苗的制备及免疫学特性

目的 制备乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)与破伤风类毒素(TT)结合疫苗,并研究其免疫学特性.方法 TT经溴化氢活化后与己二酰肼形成TT-酰肼基衍生物,在碳二亚胺作用下与HBsAg共价结合.将结合物、HBsAg及乙肝疫苗免疫小鼠,并设生理盐水对照组,分别于7、14、21、28 d取血,应用化学发光法检测小鼠血清抗-HBs,于第7、28天应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测脾单个核细胞(mouomlclear cells,MNC)分泌HBsAg特异性IFN-γ和IL-2能力.结果 成功制备了HBsAg-TT结合物,该结合物诱导抗-HBs阳转率及抗体滴度均较单独免疫HBsAg及乙肝疫苗组高,主要以IgG2a抗体为主,且分泌IFN-γ和IL-2的淋巴细胞数也显著增加.结论 用该方法 制备的HBsAg-TY结合疫苗,不仅可诱导较强的体液免疫,还可诱导以TH1应答为主的细胞免疫.     

免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法的建立

目的 建立免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并与常规乙型肝炎疫苗进行比较。方法增效乙型肝炎疫苗肌内免疫BALB/c小鼠,Elispot方法检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数（SFC）,优化实验条件：免疫剂量、检测时间和特异性刺激物及刺激浓度。同时将增效乙型肝炎疫苗与常规乙型肝炎疫苗进行比较。结果5μg免疫组IFN-γ SFC明显高于2μg免疫组,初次免疫后3周IFN-γ SFC开始下降,多肽刺激IFN-γ SFC高于蛋白刺激,多肽浓度为2μg即可充分刺激斑点形成;增效乙肝疫苗免疫组IFN-γ SFC高于常规乙型肝炎疫苗组。结论 初步建立了免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并证明其重复性良好,其细胞免疫水平高于常规乙型肝炎疫苗。     

乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价乙型肝炎疫苗免疫效果的比较

目的：比较乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价乙型肝炎疫苗的免疫效果。方法：实验动物采用豚鼠，按0、1、2月三针免疫程序接种，并于每针免疫后1个月采血，ELISA方法检测血清抗体滴度。实验分三部分进行。实验一：三种不同规格的联合疫苗与单价乙型肝炎疫苗的比较；实验二：同一规格连续三批联合疫苗与单价乙型肝炎疫苗的比较；实验三：联合疫苗与两种单价疫苗同时免疫的比较。结果：在三个实验中，联合疫苗组第一针血清抗体滴度均低于对照组，但无统计学差异：联合疫苗组第二、三针血清抗体滴度均高于对照组，也无统计学差异，实验组各组之间无明显差异。结论：联合疫苗组三针免疫程序的HBsAg的效力与单价乙型肝炎疫苗组相似。     

乙肝表面抗原核酸疫苗在小鼠体内的阳性表达

目的 :用乙肝表面抗原核酸疫苗免疫小鼠 ,探讨其在体内的表达。方法 :用含乙肝表面抗原基因的质粒载体肌注小鼠 ,免疫组化法检测HBsAg在注射部位肌组织、局部淋巴结、脾脏的表达 ;进一步用ELISA法检测血清中抗HBsAg抗体 ;脾淋巴细胞特异及非特异性增殖试验。结果 :一次免疫后 ,在注射部位肌组织可见HBsAg阳性表达 ;二次免疫后 ,在脾、局部淋巴结可见HBsAg阳性染色。血清抗体出现阳性 ;特异性抗原及ConA均可刺激脾淋巴细胞增殖。结论 :乙肝核酸疫苗肌注小鼠后 ,在骨骼肌、淋巴结、脾脏组织中HBsAg呈阳性表达 ,并出现了一定免疫应答效应。     

Immunoprophylaxis of perinatal transmission of the hepatitis B virus: efficacy of hepatitis B immune globulin and hepatitis B vaccine in a low-prevalence area

One hundred eleven newborn infants born of Spanish hepatitis B surface antigen (HBsAg) carrier mothers were consecutively assigned to one of three treatment groups. Group A was treated with three or four doses of hepatitis B immune globulin (HBIG) in one of three different schedules. Group B received one dose of hepatitis B vaccine (Hevac-B, Pasteur) at birth and at 1, 2 and 12 months. Group C was treated with the same vaccination schedule as group B and in addition received a single dose of HBIG at birth. Comparisons were made in the 85 babies who had strictly completed the immunization schedule and had been followed for at least 12 months. The three immunization protocols were equally effective, since none of the children became a chronic HBsAg carrier or developed acute symptomatic infection. There were five transient and subclinical infections among children who received only HBIG (group A), one transient infection in group B, and one in group C. There seems to be some correlation between anti-HBs levels and degree of protection, since all transient infections in group A occurred in the subgroups who did not maintain protective antibodies during the first 6 months. Although the percentage of responders in the two vaccinated groups did not differ significantly, children who received only vaccine reached higher antibody levels than those who also received HBIG. Our results suggest that any immunization schedule able to maintain anti-HBs levels during the first 6 months of life would be useful to prevent mother-to-infant transmission of the hepatitis B virus in areas where most of the carrier women are expected to be anti-HBe positive and hence relatively less infectious.     

乙型肝炎病毒治疗性多表位基因疫苗在小鼠中的免疫应答研究

目的:分析乙型肝炎病毒(HBV)重组多表位抗原基因在大肠杆菌中非融合表达的蛋白B-BPT的免疫原性,以期为HBV预防/治疗性疫苗的研制奠定实验基础。方法:构建重组质粒pBAD/BPT,并在大肠杆菌中诱导表达。以纯化的蛋白B-BPT免疫BALB/c小鼠,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测该融合蛋白诱导的小鼠细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。用流式细胞术(FCM)检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的比例,用MTT比色法检测淋巴细胞的增殖效应。结果:B-BPT蛋白免疫BALB/c小鼠后,可诱导特异性CTL应答(P<0.05,与空白对照组比较);B-BPT蛋白免疫后,可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增值(P<0.05,与空白对照组比较)。结论:该非融合表达的蛋白B-BPT可有效地诱导小鼠特异性CTL免疫应答,为进一步研制乙肝预防治疗性疫苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

CpG ODN联合乙型肝炎疫苗与乙型肝炎疫苗免疫效果对比研究

目的探讨CpG ODN乙型肝炎疫苗与市售乙型肝炎疫苗对Balb/c小鼠的免疫作用效果。方法将乙肝疫苗、乙肝疫苗+100μgCpG ODN分别肌肉注射到4～6周龄,16～18g Balb/c小鼠体内,于第1次免疫后28d以同样剂量加强免疫1次。分别于第1次免疫后28、42、63 d收集小鼠血清,用ELISA方法检测抗HBs IgG抗体。结果实验组产生的抗HBs IgG与对照组HBsIgG相比P<0.05,具有显著性差异。28、42、63 d抗HBs IgG分别是对照疫苗的114倍、4.73倍、5.41倍以上。结论 CpG ODN能够显著增强小鼠对乙肝疫苗的免疫应答,在较短时间内显著的提高乙肝抗体的产生水平,免疫效果是乙肝疫苗的5倍以上。     

不同剂量乙肝疫苗与HBIG联合免疫阻断HBV母婴传播的效果对比

目的 探讨10 μg和20 μg乙肝疫苗与HBIG联合免疫阻断HBV母婴传播的效果.方法 124例HBsAg阳性孕妇所生的婴儿随机分为两组,即10 μg乙肝疫苗组和20 μg乙肝疫苗组.婴儿于出生6h内及30 d分别注射200 IU HBIG,同时分别于出生24 h内、1个月及6个月注射3次10 μg或20 μg重组酵母乙肝疫苗.检测婴儿出生时以及1岁时血清HBV标志物.结果 两组新生儿血清HBsAg、HBeAg及抗-HBe阳性率与滴度之间差别均无统计学意义（P＞0.05）.所有新生儿血清HBV DNA水平均小于检测下限（500 U/ml）.出生12个月时,所有124例婴儿血清HBsAg和HBeAg检测结果均为阴性;血清HBV DNA水平均在检测下限以下;10 μg和20 μg乙肝疫苗组血清抗-HBs阳性率分别为90.3％和96.8％,差异无统计学意义（P＞0.05）;抗-HBs水平分别为325.5±342.2 mIU/ml和463.7±353.3 mIU/ml,后者显著高于前者（P=0.01）.而且,20 μg乙肝疫苗组产生高应答抗-HBs（＞ 100 mIU/ml）的比例显著高于10μg乙肝疫苗组（P =0.035）.结论 20 μg乙肝疫苗联合HBIG方案阻断HBV母婴传播的效果优于10 μg乙肝疫苗联合HBIG方案.     

HBV cccDNA在2.2.15细胞表达的动态观察

目的研究2.2.15细胞中是否存在HBVcccDNA,探讨2.2.15细胞内HBV产物的动态表达规律。方法采用PCR方法检测2.2.15细胞内cccDNA,Taqman定量PCR技术检测2.2.15细胞内及培养上清中HBVDNA含量,EIA方法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达,并进行定量资料相关性统计学分析。结果2.2.15细胞及培养上清中存在cccDNA,2.2.15细胞培养上清中HBVDNA与HBsAg、HBeAg之间存在相关性(r=0.833,P<0.05和r=0.939,P<0.01),而细胞内HBVDNA与培养上清HBVDNA及HBsAg、HBeAg之间无相关性(r=0.024,P>0.05和r=0.177,P>0.05)。结论为阐明2.2.15细胞内HBV的复制规律提供一定依据。     

乙型肝炎病毒新的免疫逃避株的S基因序列分析

目的分析乙型肝炎患者体内ＨＢＶＳ基因的变异情况及对乙型肝炎的免疫预防的现实意义。方法采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）、Ｍ１３噬菌体克隆和核苷酸序列分析方法对一例乙型肝炎免疫失败儿童患者体内ＨＢＶＳ基因序列进行分析。结果发现该患儿所感染ＨＢＶ的Ｓ基因上有一个重要的点突变,即第５５１位碱基由野生型的Ａ变为Ｇ。该突变使乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）１３３位氨基酸由甲硫（ＡＴＧ）变为缬（ＧＴＧ）。这一氨基酸替换恰恰发生在ＨＢｓＡｇ中和性α抗原决定簇区段（ａａ１２４～ａａ１４７）内。结论鉴于该患者接种乙型肝炎疫苗,其血清呈抗－ＨＢｓ阳性和ＨＢｓＡｇ阴性,推测其体内的ＨＢＶ为一个新的疫苗诱导的免疫逃避株     

不同剂量乙型肝炎疫苗对慢性乙型肝炎患者特异性T淋巴细胞应答反应的影响

目的研究接受不同剂量重组酵母乙型肝炎疫苗治疗的慢乙肝患者外周血淋巴细胞对疫苗的特异性细胞免疫反应。方法选择72例6个月内无使用抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者按1：1：1的比例随机分为90tLg组、60tLg组、安慰剂组（0μg）。患者同时联合使用干扰素alb5MIU每周3次共24周。所有患者均停药后观察24周。在不同的时间点检测患者HBVDNA、HBeAg及肝功能，酶联免疫斑点试验（ELISPOT）法检测产生IFN-7的细胞数。结果治疗前三组患者的ELISPOT阳性率的差异无统计学意义。治疗24周时高剂量、低剂量和安慰剂组ELISPOT试验阳性的患者分别有12例、12例和7例。重组酵母乙型肝炎疫苗组（高剂量、低剂量）ELISPOT阳性率比安慰剂组明显升高，差异有统计学意义（P=0．0446）。24例ELISPOT阳性的重组酵母乙型肝炎疫苗组（高剂量、低剂量）患者中有6例产生HBVDNA转阴、7例发生HBeAg消失或转换，而7例ELISPOT阳性的安慰剂组患者均无HBVDNA转阴及HBeAg消失或转换。停药后24周，ELISPOT阳性者中。重组酵母乙型肝炎疫苗组（高剂量、低剂量）共有4例产生HBVDNA转阴、9例发生HBeAg消失或转换，而接受安慰剂治疗组均无HBVDNA转阴、仅有1例发生HBeAg转换。结论重组酵母乙型肝炎疫苗对慢性乙型肝炎患者有提高特异性T淋巴细胞功能的作用。高剂量组和低剂量组ELISPOT阳性率差异无统计学意义。     

Failure to detect infectious hepatitis b virus using high dose safety test for hepatitis b vaccine

One hundred milliliters of an inactivated hepatitis B vaccine (20 /m?g/ml) were inoculated intravenously into two colony-born infant chimpanzees. Immediately thereafter each received hepatitis B virus from a documented infectious inoculum intravenously at a separate site. Neither chimpanzee developed elevation of aminotransferase levels, hepatitis B surface antigen (HBsAg), or antibody to hepatitis B core antigen during six months of evaluation, the duration of the currently recommended safety test. Both chimpanzees developed antibody to HBsAg beginning 8 and 9 weeks, respectively, after inoculation. The administration of a large intravenous quantity of vaccine antigen thus appeared capable of masking or preventing infection by simultaneously administered hepatitis B virus. This study suggests that a chimpanzee safety test for hepatitis B vaccine should not employ large quantities of vaccine antigen, since such a safety test may fail to detect small amounts of residual infectious hepatitis B virus.