支架蛋白JLP基因敲除小鼠的构建及其肾脏表型的初步观察

目的 繁殖和鉴定支架蛋白JLP基因敲除小鼠,对其肾脏表型进行初步观察。方法 将JLP基因敲除杂合小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠的组织DNA,用PCR技术检测小鼠的基因型,并用Western blot法验证基因敲除效果。通过PAS病理染色等观察肾脏微观结构。结果 成功繁殖并获得子代小鼠,子代小鼠有3种基因型,包括纯合子（JLP+/+、JLP-/-）和杂合子（JLP+/-）。PCR检测基因型的方法方便且结果准确。结论 笔者成功建立了JLP基因敲除小鼠模型,能够进一步探究发现JLP基因对生物体的作用及机制。     

NLRP3基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的 繁殖及鉴定NLRP3基因敲除（NLRP3^-/-）小鼠。方法 将引进的NLRP3基因敲除杂合子小鼠,单独进行饲养及配种繁殖,繁殖后其子代出现3种基因型：野生型、杂合子型及纯合子型,提取每只小鼠的基因组DNA,用PCR和T7E1酶切方法进行鉴定,将获得的纯合子小鼠与异性杂合子交配,以获得更多的基因敲除纯合子小鼠。结果 NLRP3杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得了NLRP3基因敲除纯合子和杂合子小鼠。结论 正确的饲养、繁殖及鉴定方法是从NLRP3基因敲除杂合子小鼠中获得纯合子小鼠的有效途径。     

miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的繁殖与鉴定

目的 探讨miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的可行性。方法 繁殖与鉴定了miR-5572 F1及F2代野生型纯合子及杂合子小鼠,并通过形态学、心电图记录及窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平测定来观察疾病模型。结果 F2代miR-5572纯合子敲入小鼠在形态上较野生型小鼠生长缓慢,体型较小。相较于杂合子和野生型小鼠,纯合小鼠的平均心率明显偏低（P<0.05）,差异有显著性。miR-5572纯合子小鼠窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平低于野生型（P<0.05）,差异有显著性。结论 过表达miR-5572转基因小鼠可以构建病态窦房结综合征疾病模型。     

共伴侣蛋白FKBP51在高脂诱导肥胖中的作用

目的 通过FKBP51基因敲除小鼠模型和细胞脂肪分化模型,探究FKBP51在高脂诱导肥胖中的机制。 方法 4周龄雄性野生型和FKBP51基因敲除小鼠以普通或高脂饲料单只单笼喂养6周,每周记录小鼠体重和饮食量,应用MM-100代谢笼系统,监测各组小鼠24 h内氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率和产热量的变化,对上述小鼠肝脏组织进行油红O染色,同时检测肝脏和脂肪组织代谢相关基因的表达情况。同时对取自野生型和FKBP51基因敲除小鼠的永生化成纤维细胞(MEF)进行脂肪诱导分化,观察FKBP51缺失对脂肪分化的影响。 结果 高脂饮食诱导后,两种基因型小鼠饮食量无明显变化,但与野生型小鼠相比,FKBP51基因敲除小鼠体重明显减轻,肝脏中脂滴减少。FKBP51基因敲除小鼠在基础和高脂诱导条件下,氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率以及产热量均高于野生型小鼠,肝脏中糖异生相关酶PEPCK、G6Pase等表达上调,脂肪中能量代谢相关基因UCP-1等表达上调。此外,FKBP51基因缺失的MEF诱导脂肪分化,细胞内脂滴明显少于野生型MEF细胞。 结论 FKBP51基因在脂肪合成和能量代谢方面起着重要作用,因此FKBP51基因缺失小鼠能够抵制高脂诱导的肥胖。     

NLRP6基因敲除对小鼠生长繁育和实质器官的影响

目的 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白6（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 6,NLRP6）是新发现的寡聚化核苷酸结合结构域样受体家族成员,广泛表达于肠道、肝脏、肾脏、脾脏和肌肉等组织器官,在炎症、焦亡和自噬等多种生物过程发挥广泛的调节作用。近期研究表明,NLRP6在应激条件下对多种组织器官的疾病表型具有重要影响。然而,NLRP6对组织器官生长发育的影响尚未可知。方法 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NLRP6基因敲除小鼠,饲养并记录小鼠的生长和繁殖情况。将小鼠的脾、肝、心、肾、脑、四肢和后背皮肤等组织器官进行解剖和切片染色,以评估NLRP6基因敲除对实质器官的宏观发育影响和对组织结构的微观影响。结果 在自然状态下,NLRP6基因敲除缩短了雄鼠的性成熟期并使成年雄鼠的睾丸发生不可逆的破溃与萎缩。在四肢发育上,NLRP6基因敲除诱导成年雄鼠后肢横纹肌断裂,导致后肢明显萎缩。在脾脏发育上,NLRP6基因敲除不仅显著增加了雄鼠的脾脏体积（P<0.01）还诱导雄鼠脾脏出现炎性细胞浸润。在后背皮肤上,NLRP6基因敲除引发雄鼠后背皮肤出现明显的溃疡损伤、胶原纤维增生和炎性细胞浸润。结论 在自然生长发育条件下,NLRP6基因敲除选择性影响小鼠的生殖器发育与性成熟期、后肢肌肉发育、脾脏大小及其炎症免疫状态以及后背皮肤的结构完整性,而且这一作用具有明显的雄激素依赖性。     

ALK7基因敲除对小鼠心电图的影响及可能机制

目的 探讨ALK7基因敲除对小鼠心电图的影响及可能机制。 方法 采用8~10周的C57BL/6的野生型小鼠以及ALK7 基因敲除小鼠,使用自制皮下电极连接Powerlab系统记录9:30~10时小鼠Ⅱ导联心电图,使用Labchart软件直接分析RR间期、HR、PR间期、P波宽度、QRS宽度、QT间期以及QTc,并进一步免疫组化检测PPAR-γ的表达。 结果 与正常野生型小鼠相比,ALK7基因敲除小鼠的RR间期、HR、P波脉宽、PR间期、QRS间期无明显差异(P>0.05),然而QT间期明显延长,QTc明显增大(P<0.05)。免疫组化检测ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的阳性表达率显著减少(P<0.05)。 结论 ALK7基因敲除小鼠PPAR-γ的减少可能影响小鼠心室复极变化,出现QT间期的延长。     

Kruppel样因子6对肝癌HepG2细胞的作用及其缺失对斑马鱼肝脏发育的影响

目的 探讨Kruppel样因子6（KLF6）低表达对肝癌细胞凋亡及迁移能力的影响,并以斑马鱼作为动物模型,研究klf6基因沉默对肝脏发育的作用。方法 构建敲除KLF6基因质粒,转染肝癌细胞（HepG2）及正常人肝细胞（L-02）,通过免疫印迹（WB）、凋亡及细胞周期测定、划痕实验检测KLF6基因敲除后对HepG2细胞的影响;设计合成沉默KLF6基因的吗啉代寡核苷酸（Morpholino）,显微注射入转基因斑马鱼Tg（lfabp：eGFP）胚胎中,通过免疫荧光法观察KLF6蛋白表达的变化以及对转基因斑马鱼胚胎肝脏发育表型的影响。结果 体外实验表明,L-02细胞中的KLF6蛋白的表达量明显高于HepG2细胞;敲除KLF6基因后,HepG2细胞KLF6蛋白表达明显减少、凋亡减弱、细胞周期主要集中于S期、迁移能力增强;体内实验表明,klf6基因沉默后,斑马鱼胚胎肝脏中的KLF6蛋白表达量减少,肝脏发育明显迟缓。结论 KLF6基因低表达促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,减少凋亡;且影响斑马鱼肝脏的正常发育。探讨KLF6基因低表达及其功能,可为以后斑马鱼肝癌模型建立及药物筛选提供理论基础。     

MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用

目的 于在体水平和离体水平研究MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用。方法 应用MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠和C57 BL/6野生型小鼠,行主动脉缩窄术,于术后4周取材。应用免疫荧光染色,检测心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位。应用Western blot法检测心肌组织中P-NF-κBp65和TNF-α。应用Mnk1 shRNA腺病毒转染技术,降低H9c2细胞中Mnk1的表达,给予血管紧张素Ⅱ刺激48h。应用免疫荧光染色,检测H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位。应用RT-PCR检测H9c2细胞中TNF-α mRNA的表达。结果 在体实验表明,主动脉缩窄术后4周,与野生型小鼠相比,MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位明显增多,TNF-α和P-NF-κBp65的蛋白表达明显增加。离体实验表明,MAPK相互作用蛋白激酶1表达降低的H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位明显增多,TNF-α mRNA的表达明显增加。结论 MAPK相互作用蛋白激酶1基因缺失促进压力负荷诱导的小鼠心肌组织炎症,其表达降低可促进血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞炎症。     

Coq4基因全敲除小鼠胚胎发育的表型分析

目的：通过分析辅酶Q生物合成蛋白4同系物（coenzyme Q biosynthesis protein 4 homolog ,COQ4）的编码基因Coq4 敲除（Coq4^-/- ）小鼠表型,探讨Coq4在小鼠胚胎发育中的作用。方法：引进Coq4基因全身杂合（Coq4^+/- ）小鼠模型,利用基因组 PCR鉴定小鼠基因型。观察并记录Coq4^+/-小鼠后代出生情况;通过解剖、组织学和免疫荧光法,观察野生型（wild type,WT）和 Coq4^-/- 胚胎和胎盘组织的形态结构。结果：Coq4^-/- 小鼠在胚胎日（embryonic day,E）7.5 d（E7.5）出现原肠胚形成障碍,于E10.5死亡。组织形态分析显示,与WT相比,Coq4^-/-小鼠胚胎发育严重迟缓,胎盘结构缺陷。免疫荧光染色分析发现,Coq4^-/-小鼠胎盘滋养层细胞侵袭能力减弱。结论：Coq4基因敲除导致小鼠发生胎盘缺陷和原肠胚形成障碍,Coq4为小鼠胚胎发育所必需的基因。     

酪氨酸激酶配体EphrinB2调控小鼠脑外伤后胶质瘢痕形成相关研究

研究背景：胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达增高是星形胶质细胞对中枢神经系统外伤后的自发反应,是胶质细胞活化、增殖以及胶质瘢痕形成的重要原因。该过程的调控机制目前并不完全清楚。本研究旨在探讨ephrinB2对小鼠脑外伤胶质瘢痕形成的影响。 研究方法：利用Loxp/Cre基因敲除系统,培养在中枢神经系统星形细胞中不表达ephrinB2的条件性基因敲除小鼠（KO）,基因敲除的结果采用DNA-PCR技术以及大脑切片后免疫组织化学ephrinB2/GFAP共染色方法证明。随机选取基因敲除小鼠及野生型小鼠各12只,制备改良的控制性皮层撞击小鼠闭合性颅脑损伤模型,利用尼氏染色、GFAP免疫荧光强度测量,比较损伤后28天,基因敲除小鼠与野生型小鼠脑萎缩程度以及GFAP表达程度的不同。 研究结果：本研究成功建立了在胶质细胞中特异性敲除ephrinB2的转基因小鼠种系。该基因敲除小鼠在中枢神经系统星形胶质细胞中特异性不表达ephrinB2。 通过组织病例学研究发现创伤后28天时,基因敲除小鼠和野生型小鼠均呈现不同程度的脑损伤和脑萎缩。损伤灶局部出现胶质瘢痕形成以及神经元丢失。免疫组化染色后的组织学形态分析发现,ephrinB2基因敲除小鼠损伤侧大脑半球及海马的萎缩程度均显著低于野生型小鼠（p<0.05）。基因敲除小鼠损伤侧的GFAP免疫荧光强度亦显著低于野生型小鼠（p<0.05）。 研究结论：在小鼠胶质细胞特异性敲除ephrinB2基因后,脑损伤后大脑半球GFAP免疫荧光强度以及半球和海马萎缩程度均显著降低。提示酪氨酸激酶配体ephrinB2在小鼠脑创伤修复中是促使胶质瘢痕形成的因素之一。