靶向脐带间充质干细胞的构建及其在小鼠脾脏内的定位

目的 构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体, 用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC, 使MSC具有靶向性, 将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法 用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞, 用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞, 通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内, 18 h后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。 结果 培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好, MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18 h后MSC开始出现绿色荧光, 随着培养时间的延长, 荧光强度逐渐增强, 72 h达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105(90.0%)/CD44(98%),CD73(85.0%)/CD90(98.5%)。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18 h后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞, 并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论 本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC, 靶向MSC成功定向脾脏, 并与脾脏淋巴细胞密切接触, 可用于后续的实验研究。     

雄性生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖雄性生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)小鼠, 为进行小鼠生殖系统毒性研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配, 产生子代动物, 利用分子生物学、组织病理学及活体成像等技术, 分别从分子、细胞和组织水平对子代及其亲代小鼠进行表型鉴定。结果 PCR结果表明在子代小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;活体成像可以看到在F1代小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠繁殖成功。     

利用CRISPER/Cas9技术构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠

目的：通过 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术构建卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase， LCAT）基因敲入C57BL/6小鼠并与肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠配繁得到肝脏特异性敲入Lcat基因C57BL/6小鼠模型。 为Lcat基因在肝脏相关代谢疾病发生机制的研究提供动物模型。方法：利用CRISPR/Cas9技术构建Lcat基因敲入小鼠；利用肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠与Lcat基因敲入小鼠交配得到肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠；通过PCR法鉴定小鼠的基因型 ；利用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和 Western blot 技术验证 Lcat 基因的 mRNA 水平和蛋白水平。 结果：PCR结果显示肝脏特异性敲入Lcat基因的小鼠模型构建成功；qPCR结果显示Lcat基因在肝脏中特异性高表达；WB结果显示，与对照组小鼠相比，LCAT蛋白在肝脏特异性敲入Lcat的小鼠肝脏中有明显更高的表达。结论：成功构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠，为在动物水平探索Lcat基因在肝脏相关代谢疾病中的功能及相关发病机制提供研究平台。     

精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立

目的 构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率.验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系.方法 设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以Age Ⅰ和EcoR Ⅰ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒.氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果.鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒.将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定.结果 测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功.Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果.结论 成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础.     

Sox30基因敲除致小鼠睾丸间质细胞增殖异常的研究

目的 探讨Sox30基因敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响.方法 采用HE染色法观察10周龄Sox30基因野生型(Sox30+/+)、杂合型(Sox30-/+)及纯合缺失型(Sox30-/-)小鼠睾丸组织病理形态;采用免疫组化技术检测睾丸组织中间质细胞特异性表达蛋白3β-HSD的表达水平;采用慢病毒感染及siRNA干扰技...     

Nogo受体慢病毒干扰载体在大鼠神经干细胞中的表达及其干扰效率鉴定

目的 在体外分离培养的大鼠神经干细胞内,通过慢病毒介导的shRNA实现持续稳定的NgR沉默。方法 设计并合成表达NgR shRNA的慢病毒载体,通过转染293T细胞系收集包装好的病毒颗粒。分离培养初生大鼠脊髓神经干细胞,以不同MOI值感染慢病毒,流式细胞术确定感染所需的最佳MOI值。感染慢病毒的神经干细胞经潮霉素筛选后进行单克隆培养,Western blot法检测NgR的沉默效率。取感染后不同天数的神经干细胞,实时定量PCR检测NgR沉默的稳定性。结果 神经干细胞分离培养6天后可见神经球形成;流式细胞术测定慢病毒感染的最佳MOI=10;慢病毒感染后NgR的沉默效率可达80%,并可在7~28天内维持在70%~80%。结论 慢病毒介导的shRNA可以在体外分离培养的大鼠神经干细胞内实现较为稳定的NgR基因沉默,为开展神经干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。     

睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响

目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.     

人FAM172A干扰慢病毒载体的构建及在甲状腺乳头状癌细胞中的表达

目的 构建人FAM172A干扰慢病毒表达载体,并包装成FAM172A干扰慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞予以鉴定。方法 根据人FAM172A mRNA序列设计退火Oligo,与慢病毒载体pL/shRNA/F经酶切、连接、转化、测序鉴定。病毒包装后,转染HEK293细胞测定病毒滴度。将重组慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞,利用荧光显微镜和QPCR检测FAM172A的表达。结果 重组慢病毒载体pL/shRNA/F-shFAM172A经PCR扩增及测序鉴定正确,病毒包装后荧光显微镜观察到FT293细胞中有大量绿色荧光,测定病毒滴度为5×10⁶TU/ml。FAM172A干扰慢病毒感染的甲状腺乳头状癌细胞中FAM172A表达被显著减少。结论 成功制备了人重组FAM172A干扰慢病毒,并在甲状腺乳头状癌细胞中高效减少FAM172A的表达,为进行FAM172A的功能和机制奠定了良好的基础。     

DNAJB8在小鼠睾丸生殖细胞中的表达定位

目的：探究DNAJB8［DnaJ heat shock protein family（HSP40） member B8］在小鼠精子发生过程中的表达模式。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测小鼠各脏器、不同发育时期睾丸组织以及不同生精细胞DNAJB8的mRNA转录和蛋白表达量;免疫荧光检测DNAJB8在生精细胞中的表达定位。结果：DNAJB8基因在睾丸组织中特异表达,从小鼠出生后21 d（P21）即圆形精子阶段开始DNAJB8 mRNA保持较高的表达,而DNAJB8蛋白在精子变形晚期出生后35 d（P35）才开始表达。DNAJB8蛋白主要定位在晚期精子细胞及精子鞭毛中段。结论：DNAJB8可能参与小鼠精子变形晚期的发育过程。     

外层致密纤维在Akap4基因缺陷致小鼠精子尾部多种形态异常中的作用

目的：探讨外层致密纤维(outer dense fobres，ODF)在Akap4基因缺陷引起小鼠精子尾部多种形态异常中 的作用。方法：通过基因编辑技术构建Akap4基因缺陷小鼠模型。实验分为2组：成年Akap4基因缺陷雄鼠为实验组 (n=7)，成年野生型雄鼠为对照组(n=7)，比较2组小鼠的体重和睾丸重量；采用计算机辅助精液分析(computer aided sperm analysis，CASA)检测精子活动力，改良巴氏染色(modifi ed pap staining)检测精子形态学，扫描及透射电镜观察精 子超微结构，免疫荧光检测精子尾部蛋白表达及定位，睾丸切片HE及PAS染色检测睾丸生精功能，透射电镜观察曲 精细管超微结构。结果： Akap4基因缺陷小鼠精子总活动力为8.81%，明显低于野生型小鼠(P<0.01)，且无正常形态精 子，尾部缩短与尾部卷曲比例达91.18%，明显高于野生型小鼠(P<0.01)，睾丸重量、睾丸生精功能、精子数量2组比 较差异无统计学意义(P>0.01)； Akap4基因缺陷精子的纤维鞘纵柱缺失，横肋柱结构部分残留，主段的3和8号ODF排 列紊乱，与ODF2蛋白定位结果相符；睾丸中精子纤维鞘发育障碍，无正常纤维鞘结构形成，但未见异常膨大的精子 尾部。结论：Akap4基因缺陷使纤维鞘横肋发育不良，纵肋的缺失引起3和8号ODF分离，“9+2”微管结构紊乱，使 主段管腔异常膨大，导致小鼠精子尾部多种形态异常。     

肉苁蓉苯乙醇苷对环磷酰胺致小鼠生精障碍的治疗作用及其机制

目的： 探讨肉苁蓉苯乙醇苷对环磷酰胺致生精障碍小鼠的治疗作用,并初步阐明作用机制。方法：乙醇浸提法提取肉苁蓉苯乙醇苷。40只BALB/C小鼠随机分为对照组、
模型组、肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组（50 mg/kg^-1）和高剂量组（100 mg/kg^-1）,每组10只。除对照组外,其余各组小鼠每天注射环磷酰胺（80 mg?kg-1）连续5 d,制备生精障碍小鼠模型。末次给药后,肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组和高剂量组小鼠分别给予相应剂量灌胃,对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水灌胃,每天1次,连续30 d。末次灌胃后24 h,取小鼠睾丸组织。酶联免疫法测定小鼠睾丸组织匀浆中睾酮水平,比较各组小鼠精子密度、精子活率及精子畸形率,HE染色观察睾丸组织形态学变化。结果：与对照组比较,模型组小鼠精子密度和精子活率降低（P<0.01）,精子畸形率升高（P<0.01）,睾丸组织匀浆中睾酮水平降低（P<0.01）;与
模型组比较,肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组小鼠精子密度和精子活率明显升高（P<0.01）,精子畸形率降低（P<0.01）,睾丸组织匀浆中睾酮水平升高（P<0.05或P<0.01）。组织学观察,模型组小鼠睾丸生精小管萎缩、退化,生精上皮明显变薄、生精细胞排列紊乱,腔内精子数目减少;肉苁蓉苯乙醇苷组小鼠睾丸生精上皮层数明显增多,层次分明,生精细胞排列整齐、紧密、规则,管腔内可见精子。结论：肉苁蓉苯乙醇苷对环磷酰胺所致小鼠生精障碍具有明显的治疗作用,其机制可能与改善睾丸组织中睾酮水平有关。     

慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统的构建及鉴定

目的 构建高效的慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统。方法 根据RNA干扰序列设计原则,设计4个可能的caspase-3 siRNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-caspase-3 siRNA并采用PCR和测序对其鉴定。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用RT-PCR技术检测转染后caspase-3基因敲减效率,筛选高效的GV115-caspase-3 siRNA。结果 GV115-caspase-3 siRNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带,测序结果与设计的基因序列完全吻合,4个可能的caspase-3 siRNA序列中基因敲减效率最高的可达到84.2%。结论 成功构建高效的慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统。     

干扰CD36的表达对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响

目的 研究干扰心肌组织中脂肪酸转位酶CD36的表达对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响。方法 4周龄的雄性C57小鼠,随机分为正常对照组（N-mock）、肥胖对照组（O-mock）及肥胖干预组（O-CD36）,采用高脂饮食诱导肥胖。6周龄时,经心肌注射靶向CD36（O-CD36）或靶向无关基因（N-mock、O-mock）的重组慢病毒,以下调心肌组织中目标基因的表达。16周龄时,取小鼠左心室组织,检测CD36和肌质网钙泵（SERCA2a）的mRNA和蛋白表达;并分离单个心室肌细胞,使用活细胞工作站检测心肌细胞钙瞬变。结果 肥胖小鼠心肌组织中CD36的表达较正常小鼠无显著改变,慢病毒介导的RNA干扰显著下调了CD36的表达。肥胖引起心肌细胞SERCA2a的蛋白表达降低及肌质网钙处理能力的下降;下调CD36的表达增加了SERCA2a的含量,并改善了钙调控异常。结论 下调心肌组织中CD36的表达可改善肥胖所引起的心肌细胞钙调控异常。     

VPS13A在3T3⁃L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的：明确囊泡分选蛋白13A（vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A）在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embry- onic fibroblast cells,3T3-L1）分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法：利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果：VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论：在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。     

下调心肌CPT1b的表达对肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响

目的 研究干扰心肌组织中肉毒碱脂酰转移酶-1b（CPT1b）的表达对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响。方法 4周龄的雄性C57小鼠,随机分为正常对照组（N-mock）、肥胖对照组（O-mock）及肥胖干预组（O-CPT1b）,采用高脂饮食诱导肥胖。6周龄时,经心肌分别注射靶向CPT1b（O-CPT1b）或靶向无关基因（N-mock、O-mock）的重组慢病毒,以下调目标基因的表达。10周后,取小鼠左心室组织检测RNA干扰的效率;采用Western blot法检测左心室组织中肌浆网钙泵（SERCA2a）的蛋白表达;并分离单个心室肌细胞,使用活细胞工作站检测心肌细胞钙瞬变。结果 肥胖小鼠心肌组织中CPT1b的表达增加,慢病毒介导的RNA干扰显著下调其表达。肥胖引起心肌细胞SERCA2a的蛋白表达降低及肌质网钙处理能力的下降,下调CPT1b的表达增加了SERCA2a的含量,并改善了钙调控异常。结论 下调心肌组织中CPT1b的表达可改善肥胖所导致的心肌细胞钙调控异常。     

穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡

目的：探究穹窿主体蛋白（major vault protein,MVP）对动脉内皮细胞（endothelial cell,EC）增殖的作用,揭示MVP对动脉EC发挥保护作用的潜在机制。方法：以人主动脉EC（human aortic EC,HAEC）为细胞模型,感染慢病毒以抑制或过表达 MVP。使用CCK-8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和死亡。使用凋亡抑制剂Z-VAD和坏死性凋亡抑制剂Nec-1确定细胞死亡方式。以流式细胞术检测Annexin V结合阳性率和Caspase 3活性,以Western blot检测Caspase剪切体蛋白表达以评价细胞凋亡。以荧光定量PCR和Western blot 技术鉴定靶分子,并明确MVP与靶分子之间的调控关系。结果：敲降MVP抑制 HAEC增殖,促进HAEC死亡,过表达MVP结果则相反。Z-VAD逆转MVP敲降引起的死亡,而Nec-1无此作用。过表达MVP抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,敲降MVP时作用相反。MVP通过上调干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2,IRF2）促进凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1）的转录。敲降IRF2逆转MVP过表达引起的cIAP1表达增多和凋亡抑制。结论：MVP通过上调IRF2蛋白促进cIAP1转录表达从而抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,发挥对EC的保护作用。     

局部热激对大鼠睾丸生精细胞凋亡与增殖的影响

目的 研究局部热激对大鼠睾丸生精细胞凋亡和增殖的动态变化及二者相关性的影响,以探索生精细胞凋亡与增殖的关系。方法 36只60天龄雄性Wistar大鼠随机分为对照组(22℃,20min)与热激组(43℃,20min),热激组按睾丸局部处理后1、2、3、4、5天分成5个亚组;采用HE染色分析各组大鼠曲细精管的形态变化;采用TUNEL法检测各组生精细胞凋亡情况;采用免疫组织化学方法(以下简称免疫组化)分析各组大鼠曲细精管Ki-67表达与分布的变化。结果 HE染色显示,热激后生精细胞逐渐脱落、缺失,至第4天最为严重,而第5天生精细胞有所恢复;TUNEL法检测显示,热激后各组的TUNEL凋亡信号显著增加(P<0.01),热激2天组达到高峰,热激3~5天组凋亡信号逐渐降低;免疫组化结果显示,热激后各组的Ki67表达显著下降(P<0.01),热激1天组很少见到Ki67表达,热激2~5天组Ki67表达逐渐增加;比较各组Ki67与TUNEL的比值,发现热激1~2天组二者比值小于1,热激3天组二者比值几乎等于1,热激4天组二者比值大于1。结论 睾丸局部热激可导致生精细胞凋亡,生精细胞增殖抑制,热激后早期凋亡过程胜于增殖,热激后期增殖强于凋亡过程,表明凋亡过程的可逆可能在于增殖活性增强。     

Pumilio家族基因诱导性敲除小鼠模型的构建

目的：为探究出生后Pumilio家族的功能及其缺失对个体的影响,构建Pumilio1（Pum1）和Pumilio2（Pum2）双基因诱导性敲除的小鼠模型。方法：通过小鼠交配实验得到R26-ER^T2 Cre/+Pum1^flox/flox Pum^2-/-小鼠,并将同窝雄鼠设为对照组和实验组。分别对实验组3周和成年小鼠注射他莫昔芬,在DNA、RNA和蛋白水平表征主要脏器中Pum1的敲除效果;并表征精子发生过程中的病理变化、细胞增殖及凋亡情况。结果：实验组3周和成年雄鼠的胸腺和睾丸组织中Pum1表达水平极低,敲除效率均高于50%,Pum1和Pum2双基因诱导性敲除小鼠模型构建成功。在注射他莫昔芬结束的第21天,3周雄鼠胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降,睾丸病理HE染色实验显示精子形成障碍,TUNEL和BrdU染色后计数结果显示睾丸中生精细胞凋亡增加、增殖减慢。成年小鼠在注射他莫昔芬恢复后,Pum1在胸腺、心、肝、睾丸中的表达仍有降低,但睾丸病理HE染色显示精子发生未见异常。结论：该模型的建立首次展示Pumilio家族蛋白作为未来药物靶标的潜能,为深入研究Pumilio的功能及作为肿瘤治疗靶蛋白的研究奠定了理论基础。     

精子β-actin下调对小鼠怀孕率影响的实验研究

目的：通过构建精子β-actin下调的小鼠模型探讨β-actin下调对小鼠精子活力及怀孕率的影响。方法：首先构建携带下调ACTB基因表达的shRNA序列的慢病毒载体。然后将昆明小鼠随机分为ACTB-RNAi-LV组（实验组）、5X-1-RNAi-LV组（空病毒对照组）、生理盐水组（空白对照组）,每组雄性、雌性小鼠各20只,于雄鼠4周大时睾丸局部分别注射慢病毒载体、空病毒颗粒、生理盐水。饲养至性成熟后,将各组小鼠进行组内交配,观察各组雌鼠怀孕率并提取雄性小鼠精子进行real-time PCR、Western blot及精子活力的分析。结果：成功构建β-actin下调精子的小鼠模型;实验组与空病毒对照组、空白对照组相比,精子中β-actin的mRNA表达量、β-actin表达量、精子的活力均有所降低且有统计学意义（P均<0.05）,空病毒对照组与空白对照组之间无统计学差异（P >0.05）。结论：β-actin下调精子活力明显下降,同时导致雌鼠受孕率降低。