牵张力促进BMSCs与VECs共培养体系成骨分化的体外研究

目的：研究牵张力对骨髓基质细胞（BMSCs）与血管内皮细胞（VECs）共培养体系成骨分化的作用及相关机制。方法分离培养大鼠原代BMSCs与VECs。应用Flexcell 5000加力系统,分别对BMSCs与VECs共培养组、BMSCs单独培养组和VECs单独培养组施加6%等轴循环牵张力。加力6、12、24和48 h后,利用实时定量PCR检测Runx2和血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达量,ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF的含量,碱性磷酸酶（ALP）半定量检测ALP活性。通过加入VEGF受体抑制剂Tivozanib,观察VEGF的旁分泌作用。采用SAS 8.0软件包对数据进行统计学分析。结果①加力6 h时,共培养体系Runx2 mRNA的表达量上调4.3倍(P<0.05);加力48 h时,ALP活性升高1.5倍(P<0.05)。②加力12 h时,共培养体系VEGF mRNA的表达量上调2倍(P<0.05),上清液中VEGF的含量增加10倍(P<0.05),BMSCs分泌大量VEGF,而VECs分泌极少量VEGF。③加入Tivozanib后,共培养组Runx2的表达量下调90%(P<0.05),ALP活性下调48%(P<0.05);而 BMSCs单独培养组Runx2的表达量和ALP活性分别下降30%和18%。结论牵张力促进BMSCs与VECs共培养体系中BMSCs的成骨分化,这种作用可能通过牵张应力诱导BMSCs分泌的VEGF以旁分泌方式由VECs作用于BMSCs来实现。     

乏氧对人牙周膜细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的:检测人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)在乏氧环境下乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelia1 growth factor,VEGF)的表达情况.方法:组织块法培养人牙周膜细胞,第3代细胞用于实验,分2组分别在20%O2,5%CO2,75%N2(对照组)和1%O2,5%CO2、94%N2(乏氧组)的37℃培养箱中培养24h和48h.采用RT-PCR技术和免疫组化技术检测HIF-1α和VEGF的表达情况.应用SPSS13.0软件包进行t检验、单因素方差分析及LSD检验.结果:乏氧组HIF-1αmRNA的表达与对照组相比,差别无统计学意义.乏氧24h与48h VEGF mRNA的表达显著高于对照组(P＜0.05).免疫细胞化学细胞爬片结果显示,乏氧组HIF-1α染色阳性,大量HIF-1α蛋白在胞核积聚,且表达量随乏氧时间增加而增加,而常氧组未观察到HIF-1α的表达;VEGF的表达呈时间依赖性增加,乏氧组VEGF的表达明显强于对照组.常氧48h后,VEGF呈微弱阳性表达.结论:乏氧可以改变人牙周膜细胞的代谢途径,上调HIF-1α及相关因子的表达.     

增龄性因素对正畸牙齿移动影响的实验研究

目的:探索增龄性因素对正畸牙移动过程中牙周组织内HIF-1α及VEGF的影响。方法:建立不同年龄组的正畸牙齿移动动物模型,加力1 d、3 d、7 d、14 d及28 d,用免疫组化法检测牙周组织中HIF-1α及VEGF的表达情况。结果:青少年组大鼠实验侧压力区HIF-1α表达在加力1 d、3 d时明显高于成年组大鼠;VEGF表达量在加力1 d、3 d、7 d、14 d时明显高于成年组大鼠。结论:增龄性因素可使牙周组织对矫治力的反应速率降低,缺氧调控速率减慢,最终使牙槽骨改建减慢,牙移动速率降低。VEGF参与了正畸牙移动中组织改建过程,但成年组大鼠正畸牙齿移动过程中VEGF表达量增加缓慢,使牙槽骨改建速度降低,造成牙齿移动速度减慢。     

机械牵张力诱导成骨细胞骨保护素及其配体表达的信号转导途径初探

目的：研究机械牵张力诱导成骨细胞OPG/RANKL表达变化的信号转导途径。方法：在MC3T3-E1细胞加力前半小时加入放线菌酮、吲哚美辛、染料木黄酮、PD098059等抑制剂,通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对细胞施加18%的机械牵张力,细胞的加载作用时间为24h。用RT-PCR方法检测细胞受力前后OPG/RANKL mRNA表达的变化,并进行统计分析。结果：吲哚美辛及染料木黄酮可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞OPG mRNA表达增加;PD098059可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞RANKL mRNA表达减少。结论：机械牵张力诱导的OPG表达增加可能是通过环氧合酶或者前列腺素合成途径,也可能是通过酪氨酸磷酸化途径,机械牵张力诱导RANKL表达的减少可能是通过ERK-MAPK途径。     

人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下核心结合因子mRNA的表达

目的 探讨人牙周膜细胞在应力作用下的成骨特性及核心结合因子(corebinding factor a 1，cbfal)在正畸成骨和正畸牙齿移动中的作用机制。方法 体外原代培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，进行大鼠cbfal cDNA片段的克隆和序列测定，制备大鼠cbfal cDNA探针。人牙周膜细胞在弹性膜上体外培养，采用体外培养细胞加载系统加载弹性牵张力。用原位杂交方法检测cbfal mRNA的表达。结果 正常对照组不加力的人牙周膜细胞未检测到cbfal mRNA阳性表达，实验组加载弹性牵张力的人牙周膜细胞出现cbfal mRNA阳性表达。结论 弹性牵张力可以诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化；cbfal作为转录因子是正畸成骨的调控途径之一。     

低氧对大鼠髁突软骨细胞HIF-1α和VEGF表达的影响

目的:探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-lα,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表达变化在髁突软骨生长发育中的意义。方法:选用3周龄SD大鼠的髁突软骨进行原代细胞培养,建立二氯化钴(CoCl2)化学低氧的细胞培养模型,RT-PCR检测常氧状态下与低氧后12、24、48 h内大鼠髁突软骨细胞HIF-1α和VEGF的mRNA表达。结果:髁突软骨细胞低氧培养后12、24 h、48 h时间点HIF-1α和VEGF的mRNA表达均明显升高(P<0.05);并且VEGF、HIF-1α表达12 h与24 h、12 h与48 h、24 h与48 h比较差异均有统计学意义;HIF-1α表达逐次升高,而VEGF在12 h达到最高点后逐次下降,但是均高于常氧状态下。结论:低氧早期可上调髁突软骨细胞HIF-1α、VEGF mRNA表达,可能在髁突软骨血管形成及生长发育发挥重要作用。     

白细胞介素1β增强口腔鳞状细胞癌细胞体外侵袭能力及其机制研究

目的探讨白细胞介素1β(IL-1β)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞体外侵袭能力的影响及相关机制。方法以OSCC系SCC-9为研究对象,用IL-1β与其体外共培养。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α、VEGF、CXCR1的mRNA的表达情况。结果 IL-1β刺激对SCC-9细胞的增殖能力无影响;IL-1β与SCC-9细胞共培养8h可显著增强其细胞侵袭能力(P<0.05);IL-1β可以显著地提高CXCR1和HIF-1α的转录水平(P<0.05);SCC-9细胞经600ng/ml的IL-1β刺激后,VEGF的mRNA表达出现上调(P<0.05)。结论 IL-1β可以增强SCC-9细胞的体外侵袭能力,并可能与HIF-1α、VEGF、CXCR1等基因的上调有关。     

缺氧对口腔扁平苔藓角质形成细胞增殖及缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9表达的影响

目的 探讨缺氧对人口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)角质形成细胞增殖及缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1 α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响,以期为OLP发病机制的研究提供新思路.方法 体外分离培养OLP角质形成细胞;使用密闭培养箱模拟缺氧环境,分为常氧组和缺氧组,两组细胞分别培养12、24、36及48 h,采用细胞计数试剂盒8的方法监测缺氧各时点细胞增殖状况,并确定进一步实验干预时间点,每组实验均重复3次;SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测各组细胞HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平,并采用相关性分析研究VEGF、MMP-9与HIF-1α的相关性.结果 24、36、48 h缺氧组OLP角质形成细胞增殖力(A值)(分别为0.340±0.002、0.415±0.006、0.546±0.006)均显著低于同时间点常氧组(分别为0.431 ±0.001、0.620±0.004、1.022±0.005),P＜0.01; 24、36、48 h缺氧组VEGF(2.087±0.291、3.189±0.573、5.402±0.563)及MMP-9(2.936±0.500、4.083±0.300、6.374±0.858)的mRNA表达量均显著高于常氧组(P＜0.05),HIF-1α (0.414±0.093、0.751±0.056、0.875±0.040)、VEGF (0.393±0.046、0.557±0.078、0.767±0.045)及MMP-9 (0.250±0.053、0.384±0.038、0.611 ±0.092)的蛋白表达量均显著高于常氧组(P＜0.05).HIF-1α与VEGF(r =0.905,P=0.000)及MMP-9(r =0.881,P=0.000)的蛋白表达水平均呈显著正相关.结论 缺氧在一定时间内可抑制OLP角质形成细胞增殖,上调细胞中HIF-1α蛋白、VEGF及MMP-9 mRNA和蛋白的表达;缺氧环境下HIF-1α可能通过调控下游靶基因参与OLP的病情进展.     

周期性牵张力加载下人牙周膜细胞中血管内皮生长因子表达变化的研究

目的：观察周期性牵张力作用下，体外培养的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLFs)中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的变化，以探讨机械力介导下牙周组织改建的机制。方法：通过体外细胞培养加载系统，采用周期性牵张力(每分钟6个循环，12％形变量)加载l、3、5、7d，用免疫组化和原位杂交技术，观察VEGF在HPLFs中的表达。结果：HPLFs在体外表达VEGF，其蛋白水平及mRNA水平的表达从加力ld开始升高，5d达到高峰，在加力7d开始下降。结论：在一定条件下，周期性牵张力可显著影响HPLFs VEGF的蛋白和mRNA水平的表达，进一步证实机械力作用下，VEGF参与了牙周组织改建，在正畸牙齿移动的机制中具有重要意义。     

HIF-1α基因修饰的牙髓干细胞成血管的体外研究

目的 探讨低氧诱导因子1α( hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α )基因对体外诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)成血管分化方法并进行鉴定。方法 取拔除的健康、完整的前磨牙标本20例,提取DPSCs细胞,采用Strol-1、CD146分子进行鉴定。根据DPSCs是否转染HIF-1α基因分为实验组和对照组,RT-PCR法测定HIF-1α mRNA表达,Western 印迹检测培养1、4、7、14 d不同时间段HIF-1α及成血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2及PDGF的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 倒置相差显微镜观察,DPSCs多数细胞呈圆形、椭圆形类,免疫荧光观察到Strol-1、CD146均呈绿色荧光。实验组HIF-1α蛋白、mRNA随着时间的延长,表达水平越来越高,差异显著(P＜0.05)。实验组转染后1、4、7、14 d后与对照组相比,HIF-1α蛋白、mRNA显著增高(P<0.05)。对照组血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随时间的延长,其表达水平无显著差异(P>0.05)。实验组VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随培养时间延长,其表达水平逐渐升高,不同时间点间差异显著(P<0.05)。与对照组相比,转染后1、4、7、14 d差异显著(P<0.05) 。结论 HIF-1α基因修饰DPSCs能够成功体外诱导其血管分化作用,为进一步血管形成研究奠定了基础。     

牵张力作用下甲状旁腺激素相关蛋白对人成骨样细胞增殖的影响

目的研究牵张力作用下甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）对人成骨样细胞增殖的影响。方法建立体外培养细胞牵张力施力模型。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测PTHrP mRNA的表达及12%牵张应变作用下PTHrP（1 nmol/L）对MG-63细胞c-fos mRNA表达的影响。检测不同浓度PTHrP（0、0.01、0.1、1 nmol/L）及12%牵张应变联合作用12 h后对细胞增殖活性的影响。结果不同牵张力对PTHrP mRNA表达影响的差异具有统计学意义,12%牵张应变组作用的影响最为显著。牵张力联合PTHrP刺激下培养较PTHrP或牵张力的单独效应具有更强的促MG-63增殖作用。牵张力联合PTHrP作用较牵张力的单独效应具有更强的增加MG-63细胞c-fos mRNA表达的作用。结论牵张力可显著影响人成骨样细胞PTHrP mRNA的表达水平。PTHrP在牵张力环境下较牵张力的单独效应具有更强的促MG-63增殖作用。在牵张力环境下PTHrP可能通过c-fos信号传导途径影响成骨细胞增殖。     

机械力作用下人牙周膜细胞Osterix mRNA和蛋白的表达

目的研究在机械力作用下人牙周膜细胞内Osterix（Osx）mRNA和蛋白的表达变化,探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法组织块法培养人牙周膜细胞,采用离心加力装置对细胞分别加载1、2、4、6、8、12 h的机械力。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot及细胞免疫荧光化学技术分别检测不同时间点Osx mRNA和蛋白的表达变化及其细胞定位。结果在正常人牙周膜细胞中,Osx mRNA表达微弱,蛋白未见表达;在机械力加载4 h后,Osx mRNA表达开始明显增强（P<0.01）,蛋白呈现弱表达（P<0.05）;加载8 h时,Osx mRNA和蛋白表达显著增强（P<0.01）;持续增加至加力12 h。同时,加力4 h后,少量细胞的胞质内开始呈现微弱的绿色荧光;12 h后,阳性表达主要集中在胞核内。结论机械力可诱导人牙周膜细胞Osx表达增强及活化。Osx可能参与了细胞内生物力学信号的转导,从而可能在正畸牙周组织的骨改建过程中发挥着重要作用。     

低氧诱导下舌鳞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF的表达及TSA对其表达的抑制

目的:观察低氧与人舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF表达的相关性,曲古抑菌素A(TSA)对其表达的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:体外培养的舌鳞状细胞癌SCC-6细胞,经不同作用时间去铁胺处理,模拟低氧条件培养后,RT-PCR检测HIF-1α、VEGF的mRNA表达,Western Blot检测其蛋白表达;模拟低氧条件下,不同浓度、时间梯度TSA处理SCC-6细胞后,分别检测HIF-1α、VEGF的mRNA及蛋白表达。结果:①低氧下SCC-6细胞HIF-1α蛋白表达增加,但其mRNA的表达不受影响;作为HIF-1α下游基因的VEGF的mRNA和蛋白表达,随HIF-1α蛋白表达增加而增加;②低氧下,TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA和蛋白表达,并呈量效和时效关系,但HIF-1α的mRNA表达不受影响;③HIF-1α的调节在蛋白水平。结论:体外条件下,模拟低氧可诱导舌鳞状细胞癌SCC-6细胞中HIF-1α蛋白、其下游基因VEGF的mRNA和蛋白的表达增加。TSA可抑制HIF-1α的蛋白表达,进而抑制其下游基因VEGF的表达,从而发挥抗肿瘤血管生成的作用,并且呈量效和时效关系。     

周期性牵张力对人牙周膜细胞MMP-1 mRNA表达的影响

目的:观察周期性牵张应力对人牙周膜细胞(HPDLF)的MMP-1 mRNA表达的影响.方法:对培养在弹性膜培养板上的HPDLF施加0.2 Hz、12%形变率的周期性牵张力,利用原位杂交和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察HPDLF的MMP-1 mRNA的表达.结果:体外培养的HPDLF正常情况下表达MMP-1 mRNA,加载周期性牵张力12 h、24 h、48 h后,随着作用时间的延长,HPDLF的MMP-1 mRNA有持续增强的趋势.结论:周期性牵张力作用下,HPDLF的MMP-1 mRNA的表达增强,加速ECM的代谢活动.     

BMP-2在减阻牵张快速牙移动不同加力方式下的表达及对牙移动的影响

目的：观察不同牵张力下减阻牵张快速牙移动中 BMP-2的表达。方法：Beagle 犬12只,随机均分为加力5、15 d、加力15 d 保持固定10、90 d 4组。以44为移动牙,每个组3只犬的6颗移动牙随机采用减阻-牵张方法、减阻-常规方法和常规方法各2颗。各组犬按预定时间处死并获取移动牙牙周组织块,免疫组化法染色并观察 BMP-2表达。结果：各加力方式下 BMP-2阳性表达分布区域相似,均在加力结束时达峰值,其中减阻牵张组峰值最大（P ＜0．05）;牙移动距离最大（P ＜0．01）。加力各时间点,减阻常规组 BMP-2阳性表达均强于常规方法组但不及减阻牵张组显著;保持固定90 d,3组无差异（P ＞0．05）。结论：减阻措施配合持续强牵张力可显著提高移动牙牵张新骨区 BMP-2阳性表达,加速牙周组织新骨形成。     

肿瘤坏死因子α对体外培养人牙囊细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对体外培养人牙囊细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法原代培养人牙囊细胞,传代至第4代,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测TNF-α对体外培养人牙囊细胞VEGF mRNA表达及上清液中VEGF含量改变的浓度和时间效应。结果①不同浓度TNF-α作用1h后,TNF-α处理组人牙囊细胞VEGF mRNA表达均较对照组增强(P<0.05),最佳效应浓度为25ng/ml;不同浓度TNF-α作用12h后,除1ng/ml组外,其余各组上清液中VEGF蛋白含量明显高于对照组(P<0.05)。②在时间效应上,25ng/mlTNF-α作用1h后人牙囊细胞VEGF mRNA表达最强,然后随时间延长其表达逐渐下降,但仍强于对照组(P<0.05);细胞培养上清液中VEGF蛋白含量随时间延长逐渐增加,但TNF-α处理组VEGF蛋白含量高于对照组(P<0.05)。结论TNF-α能够促进体外培养人牙囊细胞合成并分泌VEGF。     

人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下核心结合因子mRNA的表达

目的 :探讨人牙周膜细胞在应力作用下的成骨特性和核心结合因子 (core bindingfactor α1,CBF α1)在正畸成骨中的作用机制 ,及其在正畸牙齿移动中的作用机制。方法 :组织块法原代培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞 ,用大鼠颅骨成骨细胞进行CBFα1cDNA片段的克隆和序列测定。制备大鼠CBF α1cDNA探针。组织块法原代培养人牙周膜细胞 ,弹性膜及体外培养细胞加载系统加载弹性牵引力 ,在加力状态下细胞分别培养 12h ,2 4h和 4 8h ,对照组培养板在同一孵箱内培养。原位杂交方法检测CBF α1mRNA的表达。结果 :倒置显微镜下观察 ,原代培养的成骨细胞呈多角形 ,呈复层重叠生长 ,可形成钙化结节。人牙周膜细胞的形态为长梭形 ,呈放射状生长。RT PCR方法从大鼠颅骨成骨细胞RNA中克隆出的CBF α1cDNA片段 ,大小约 70 0bp。正常人牙周膜细胞未检测到CBF α1mRNA阳性表达。加力 12h ,2 4h和 4 8h的人牙周细胞中均见有CBF α1mRNA阳性表达的细胞。结论 :弹性牵张力可以诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化 ;CBF α1是正畸成骨的调控途径之一。     

碱性成纤维细胞生长因子对人牙周膜细胞多配体蛋白聚糖-4基因表达的影响

目的 通过研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜细胞(PDLC)多配体蛋白聚糖-4 mRNA水平表达的影响,探讨bFGF在人PDLC迁移中的作用.方法 收集正畸拔除的12～18岁青少年健康前磨牙68颗,体外原代培养人PDLC,用外源性bFGF刺激细胞,培养24、48、72 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞内多配体蛋白聚糖-4 mRNA的表达.结果 培养24h时,实验组多配体蛋白聚糖-4 mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.01),其中1.0 ng·mL-1组升高最为显著;培养48h时,1.0 ng·mL-1组多配体蛋白聚糖-4 mRNA表达量高于对照组(P＜0.05);培养72h时,1.0 ng·mL-1组多配体蛋白聚糖-4mRNA表达量低于对照组(P＜0.05).结论 初期bFGF促进人PDLC内多配体蛋白聚糖-4mRNA合成,但随着时间的延长,bFGF抑制多配体蛋白聚糖-4mRNA合成,这种改变是促进PDLC迁移过程中一个重要的调节因素.     

增龄因素对鼠正畸牙齿移动中牙周组织骨保护素（OPG）表达的影响

目的 比较在正畸牙齿移动中幼年鼠和成年鼠牙周组织骨保护素(osteoprotegerin,OPG)信使RNA(mRNA)表达的不同,以探讨增龄因素影响正畸骨改建的分子机制。方法以4周(幼年鼠)和24周(成年鼠)雄性大鼠为实验动物,牵引左上第一磨牙近中移动为正畸牙齿移动模型,原位杂交检测牙周膜组织OPG mRNA的表达。结果 1.幼年鼠正畸牙齿移动中加力后3小时张力侧近牙槽骨表面可见OPG表达阳性细胞排列;与幼年鼠相比,成年鼠加力后牵张侧牙周膜细胞的OPG mRNA表达没有明显改变。2.幼年鼠加力后6小时开始压力侧即可观察到破骨细胞的数目明显增多,成年鼠加力后,压力侧加力24小时可见破骨细胞;无论幼年和成年鼠压力侧牙周膜细胞的OPG mRNA表达在加力前后均未见明显改变。结论 增龄因素使牙周组织内OPG表达明显增强;成年牙周组织中较强的OPG表达可能与成人正畸出现的牙槽骨吸收、牙齿移动迟缓相关。