阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞的体外扩增

目的研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者CD34+CD59+细胞的分离、纯化及其体外扩增的条件和性能,为探索PNH新的治疗途径提供实验依据.方法利用免疫磁珠-流式细胞仪二步分选法,从PNH患者骨髓中分选出CD34+CD59+细胞,然后对CD34+CD59+细胞在不同造血生长因子组合条件下,进行体外扩增培养2周.结果体外扩增的最适宜的生长因子组合为SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo+Epo,最适宜的扩增时机为第7天,在此条件下,CD34+CD59+细胞的扩增倍数为22.42±3.73倍.CD34+CD59+细胞在扩增以后,仍保持较好的形成集落形成单位的能力,但是其向多系分化的潜能有所下降.结论 PNH患者CD34+CD59+细胞能够进行体外扩增.按照最佳扩增条件,在对PNH患者进行自体骨髓移植或自体外周血干细胞移植时有一定的应用价值.     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究

目的 探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患CD34^ CD59^ 细胞的特性及PNH克隆呈优势造血的可能原因，以探索PNH发病的内在机制。方法 用免疫磁珠吸附法富集纯化CD34^ 细胞，再用流式细胞仪分选出PNH患的CD34^ CD59^ 细胞、CD34^ CD59^ 细胞及正常对照CD34^ 细胞。分别进行体外扩增液体培养2周，并对扩增前、后的细胞进行半固体培养。结果 ①PNH患CD34^ CD59^ 细胞与正常对照CD34^ 细胞形成集落形成单位(CFU)均在第7天达到扩增高峰，并且扩增后的细胞仍能保持CD59抗原，无GPI锚连蛋白的丢失。②正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于FHN患的CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^-细胞.③PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，其形成CFU的能力无明显差异。④PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞在SCF IL3 IL6 FL Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异。但在SCF IL3 IL6 FL Tpo Epo GM-CSF组合下液体培养，CD34^ CD59^ 细胞的生存、增殖、扩增能力均明显强于CD34^ CD59^ 细胞。结论 ①正常对照的CD34^ 细胞在生存、增殖、形成CFU及扩增能力上均明显强于PNH患的CD34^ CD59^ 细胞。②PNH患CD34^ CD59^ 细胞及CD34^ CD59^ 细胞体外半固体培养，以及在SCF IL3 IL6 LF Tpo及SCF IL3 IL6 FL Tpo Ep组合下液体培养，其生存、增殖、扩增等能力上均无明显差异，说明CD34^ CD59^ 细胞在造血能力上并无内在的优势。GM—CSF或许是使PNH克隆呈造血优势的原因之一。     

裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34+CD59+细胞的研究

应用BALB／c裸鼠为移植模型，将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）病人的CD34^＋CD59^＋细胞进行移植。研究其增殖能力和重建造血的情况，为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植（ABMT）或自体外周血干细胞移植（APBSCT）奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法。从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34^＋CD59^＋细胞进行体外扩增，并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。结果显示：移植6周后，用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45^＋细胞，而接受PNH病人CD34^＋CD59^＋细胞移植后的裸鼠，其血常规指标有一定恢复，但并未完全恢复。结论：PNH病人骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。     

CD59和阵发性睡眠性血红蛋白尿

ＣＤ５９是血细胞表面的一种糖基磷脂酰肌醇锚连蛋白，具有抑制补体激活的作用。阵发性睡眠性血红蛋白尿（ＰＮＨ）患者血细胞表面可存在ＣＤ５９等描连蛋白的缺陷，用流式细胞仪检测血细胞表面ＣＤ５９等锚连蛋白的表达有助于ＰＮＨ的诊断，随访和治疗。本文重点综述了流式细胞仪检测ＣＤ５９在ＰＮＨ诊断，治疗中的最新进展。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症实验室诊断

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得 的血细胞膜缺陷的克隆性疾病,临床上可表现血管内溶 血、栓塞、全血细胞减少等,有时可出现骨髓衰竭[1]。现 已证实,大多数PNH患者异常克隆与正常造血并存,使本 病的诊断和发病机制的研究受到限制。PNH患者红细胞 膜表面缺乏加速衰变因子(DAF,CD55)、反应性溶血的膜 抑制物(MIRL,CD59)和C8结合蛋白(或称同种限制因 子,HRF)等,使红细胞对补体敏感而溶血。上述3种蛋 白都经糖基化磷脂酰肌醇(GPl)连接在细胞膜上[2]。近 年来,由于各种检测技术的发展使得PNH发病机制的研 究、PNH…     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症实验室诊断

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得的血细胞膜缺陷的克隆性疾病,临床上可表现血管内溶血、栓塞、全血细胞减少等,有时可出现骨髓衰竭。现已证实,大多数PNH患者异常克隆与正常造血并存,使本病的诊断和发病机制的研究受到限制。PNH患者红细胞膜表面缺乏加速衰变因子(DAF,CD55)、反应性溶血的膜抑制物(MIRL,CD59)和C8结合蛋白(或称同种限制因子,HRF)等,     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症研究近况

阵发性睡眠性血红蛋白尿症研究近况杨仁池综述郝玉书审校阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）是一种后天获得性血细胞膜缺陷的克隆性疾病，典型病例以慢性血管内溶血为特征。大多数ＰＮＨ患者异常克隆与残余正常造血并存，使本病的发病机制研究受到限制。已知ＰＮＨ患者红...     

CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断中的意义

目的　探讨CD5 9检测对阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (paroxysmalnocturnalhemoglobinuria ,PNH)及再生障碍性贫血 (AA) PNH综合征的临床诊断意义。方法　用FITC标记的CD5 9单抗 ,以流式细胞仪检测 13例PNH、37例AA和 2 0例正常人外周血红细胞和粒细胞膜表面CD5 9的表达情况。结果　正常人红细胞和粒细胞CD5 9表达阳性率均 >98% ;13例PNH患者红细胞及粒细胞CD5 9表达阳性率均 <90 % ;37例再障患者中 2 4例表达正常 ,13例红细胞或粒细胞CD5 9表达阳性率均有不同程度的减低。结论　CD5 9检测是诊断PNH较直接而又特异、敏感的方法 ,特别是对表现不典型的PNH及AA PNH综合征的诊断具有重要意义     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症的研究进展

阵发性睡眠性血红蛋白尿症的研究进展杜涛综述张之南审校阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）是一种后天获得的克隆性疾病。因造血干细胞发生Ｘ染色体上ＰＩＧ－Ａ基因突变，致糖化磷脂酰肌醇（ＧＰＩ）合成障碍，使ＧＰＩ锚连蛋白缺乏，其中包括一些补体调节蛋白，由变异...     

磁珠双阳性分选法在阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增的应用

应用磁珠双阳性分选法在体外扩增阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患的CD34 CD59 细胞，为实现PNH患进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础。流式细胞术分选虽然经常用于细胞纯化，但难于满足大规模临床细胞分选的需要。本研究利用免疫磁珠系统，应用隔夜孵育法去除第一次分选时CD34 细胞吸附的磁珠，经过两次磁珠双阳性分选，从PNH患骨髓中分离出足够数量的CD34 CD59 细胞，用于体外培养扩增。结果显示：磁珠双阳性法分选的CD34 CD59 细胞与磁珠—流式细胞术二步分选法比较，在细胞生存、增殖、扩增及形成造血集落形成单位(CFU)的能力上均无显性差异。结论：磁珠双阳性分选法可能推广应用于其它双阳性或多阳性细胞的分离纯化，尤其是造血干／祖细胞的分离纯化。     

PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究

本研究应用BALB／c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobin—uria，PNH）患者CD34^＋CD59^＋的增殖和重建造血的能力，为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据。利用免疫磁珠双阳性分选法，从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34^＋CD59^＋细胞，分别进行体外扩增，并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞分别输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45^＋细胞。结果表明：PNH组的CD34^＋CD59^＋细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组。但CD34^＋CD59^＋细胞输注给受鼠后6周，在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45^＋细胞，PNH组受鼠CD45^＋细胞水平与正常人对照组相比，无统计学差异。结论：PNH患者CD34^＋CD59^＋细胞仍具有同正常人CD34^＋CD59^＋细胞相同的生物特性，能体外扩增并能保持正常干／祖细胞的特性。     

外周血CD34+细胞计数预测造血干细胞收获量

目的了解外周血CD34+细胞计数与造血干细胞收获量的关系.方法用流式细胞仪Pro-COUNT方法检测了16例造血干细胞移植患者单采前外周血和采集物中CD34+细胞百分率、绝对数,用血细胞计数仪计数白细胞数.分析各项检测指标与CD34+细胞收获量(×106/kg体重)的相关性.结果外周血白细胞计数、CD34+百分率、CD34+细胞计数与CD34+细胞收获量的相关系数分别为-0.307,0.738,0.665.经相关系数t检验,单采前外周血白细胞计数与CD34+收获量无相关性(P＞0.05),而外周血CD34+百分率和绝对计数与CD34+收获量密切相关(P＜0.01).结论外周血CD34+计数可准确预测采集效果,确定干细胞采集时机.     

Flt3和c-kit在脐血CD34+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34~+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34~+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34~+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3~+,(50.6±12.7)％为c-kit~+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34~+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。     

脐血中CD34+CD38+细胞含量对急性白血病患者移植后造血重建的影响

为了探讨非亲缘脐血移植中CD34+ CD38+ 细胞回输量对造血重建的影响 ,采用流式细胞术分析复苏后的CD34+ CD38+ 细胞数 ,并对 2 0例急性白血病患者的体重、中性粒细胞 (ANC)和血小板 (Plt)恢复时间进行测定。结果表明 :2 0例接受的CD34+ CD38+ 细胞输入量为 (9.85 - 32 5 .71)× 10 4/kg ,其ANC恢复 >5× 10 8/L的中位时间为 18 5 (11- 32 )天。在 19例患者中Plt恢复 >2× 10 10 /L的中位时间为 4 5 (12 - 118)天。CD34+ CD38+ 细胞输入量与ANC和Plt恢复时间存在相关 ,r值分别为 - 0 .5 77(P <0 .0 1)和 - 0 .5 0 3(P <0 0 5 )。结论 :CD34+ CD38+细胞含量与造血恢复时间相关 ,足量输入CD34+ CD38+ 细胞可能使植入提前     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

三七皂苷对人骨髓CD34+造血干/祖细胞的增殖分化作用

为了探讨三七皂苷 (PNS)对人骨髓CD34+ 造血干 /祖细胞的刺激增殖和诱导分化的作用 ,用DynalM 4 5 0CD34+ 免疫磁珠阳性选择法获取高纯度的人骨髓CD34+ 细胞 ,采用多向祖细胞 (CFU Mix)体外集落培养和流式细胞术检测细胞增殖与分化。结果显示 :经免疫磁珠阳性选择 ,从骨髓细胞收获的CD34+ 细胞获得率为 (1.0 3±0 .74 ) % ,流式细胞术分析纯度达到 86 % - 93%。PNS 10mg/L和 2 5mg/L能刺激CD34+ 细胞增殖 ,使CFU Mix集落生成增加 ,2 5mg/L的PNS对CFU Mix产率提高 (34.7± 16 .0 ) % (P <0 .0 1) ,是促进造血的最适浓度 ;PNS2 5 ,5 0和 10 0mg/L时 ,能诱导CD34+ 细胞向粒系细胞分化 ,粒系表面标记CD33+ 和CD15 + 的细胞百分比均明显高于无PNS的对照组 ,而红系细胞表面标记CD71+ 和G A+ 细胞百分比则无明显变化。结论 :PNS对CD34+ 造血干 /祖细胞不但具有显著的刺激增殖作用 ,而且能够诱导其向粒系细胞定向分化的效应     

脐血CD34＋细胞体外诱导扩增红系细胞的探索

本研究利用脐血CD34＋细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径。利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34＋细胞,并通过问充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2．52×10^5,其中95％以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1％以内。无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系。结论：利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓中正常及异常造血细胞Bcl-2及Bax表达的初步观察

观察了阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)病人骨髓中正常及异常造血细胞培养前、后Bcl-2及Bax的表达,并与正常对照作了比较,以探讨二者生存能力差异的可能机制。实验采用间接免疫荧光标记及流式细胞术检测。结果发现PNH病人骨髓中正常(CD59~ )及异常(CD59-)单个核细胞(BMMNC)培养前、后Bcl-2和Bax表达阳性率及Bcl-2表达的平均荧光强度值(MFI),与正常对照相比均无显著性差异,但Bax表达的MFI值则均较正常对照者显著升高,由此导致病人BMMNC的Bcl-2及Bax的MFI比值降低,但病人正常及异常BMMNC之间Bcl-2及Bax表达的MFI值则无显著性差异,表明PNH病人BMMNC Bax分子表达增多导致Bcl-2与Bax分子比例失衡可能是其较正常BMMNC生存能力降低的原因之一,而病人正常及异常BMMNC生存能力的差异除Bcl-2和Bax调节机制外,可能还涉及其它与细胞凋亡有关的步骤及环节。