抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

嗜水气单胞菌抗独特型单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydophila)抗独特型单克隆抗体(AId mAb)并进行鉴定.方法:以具有中和作用的抗嗜水气单胞菌 mAb 1G10免疫 BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备嗜水气单胞菌 AId mAb.用 ELISA法对 mAb的效价及其模拟嗜水气单胞菌的特性进行鉴定.结果:获得4株能稳定分泌嗜水气单胞菌 AId mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、 1H10、 3F5、 4G3.经测定杂交瘤细胞腹水 mAb效价为10 -4～10 -5.竞争抑制实验结果表明 4株 AId mAb均能不同程度地抑制嗜水气单胞菌与兔抗嗜水气单胞菌多克隆抗体结合,其中两株 1F9、 1H10具有较强的抑制作用.用作制备抗独特性抗体腹水的小鼠,其血清均能检测与嗜水气单胞菌进行免疫结合的抗体,经 ELISA检测,其效价为 1: 100 ～1: 1 000.结论:成功地制备了产生嗜水气单胞菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株,为制备该菌的抗独特性抗体疫苗奠定了基础.     

豚鼠气单胞菌抗独特型单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)抗独特型单克隆抗体(AIdmAb)并进行鉴定。方法:以具有中和作用的抗豚鼠气单胞菌mAb1F1免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备豚鼠气单胞菌AIdmAb。用ELISA法对mAb的效价及其模拟豚鼠气单胞菌的特性进行鉴定。结果:获得4株能稳定分泌豚鼠气单胞菌AIdmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1E12、4F6、6G6、7C1。经测定杂交瘤细胞腹水mAb效价为10-3～10-4。竞争抑制实验结果表明4株AIdmAb均能不同程度地抑制豚鼠气单胞菌与兔抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体的结合。制备杂交瘤细胞腹水的BALB/c小鼠血清均能与豚鼠气单胞菌反应,其效价为1∶50～1∶800。结论:成功地制备了豚鼠气单胞菌抗独特型mAb的杂交瘤细胞株,为该菌的抗独特型疫苗制备研究奠定了基础。     

抗HCV HVR1模拟合成肽单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗-HCV高变区1(HVR1)合成肽单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以固相合成的HCV HVR1合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,免疫8周龄的BALB/c小鼠。采用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备抗-HCV HVR1 mAb。经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后,用相关的试剂盒鉴定小鼠mAb的Ig亚类;经中和抑制后用ELISA法检测mAb的特异性;用间接ELISA法检测mAb腹水的效价及相对亲和常数。结果:获得1株可分泌抗-HCV HVR1合成肽特异性mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11。该株mAb的Ig亚类为IgG3;腹水效价为3.125×10-5;相对亲和常数为1.0×106L/mol。该株mAb与HBsAg、HBeAg、HBcAg、HAAg、牛血清白蛋白、酪蛋白和胸腺5肽均无交叉反应,与HCV HVR1合成肽-牛血清白蛋白出现特异性反应。结论:成功地建立了1株可分泌抗-HCV HVR1 mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11,为进一步的实验研究提供了重要的制剂。     

抗丁型肝炎病毒mAb的制备及其初步应用

目的 :以基因工程表达丁型肝炎病毒抗原蛋白 (HDAg)为抗原 ,建立分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞系 ,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法 :用Ni NTA技术纯化HDAg免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备mAb。采用ELISA及免疫组化技术进行鉴定。结果 :筛选出 2株能稳定分泌特异性抗 HD的mAb杂交瘤细胞株 (HD1,HD2 ) ,经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体 ,特异性强 ,效价高。应用于ELISA测定患者血清HDAg均呈特异性阳性反应。免疫组化检测肝组织显示 ,针对该mAb的抗原主要分布于细胞核或浆内。结论 :此两株丁肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丁肝抗原具有特异亲和性 ,为丁型肝炎病毒的临床诊断及病理检测提供技术基础     

鼠抗人内皮抑素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人内皮抑素的单克隆抗体(mAb),为深入研究内皮抑素的作用机制提供一种有用的试剂。方法:以毕赤酵母表达的内皮抑索为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,以间接ELISA法筛选分泌抗人内皮抑素的特异性mAb的杂交瘤细胞株,并诱生腹水。腹水中的mAb采用 Protein A Sepharose CL-4B进行纯化。以标准的抗Ig血清做ELISA,鉴定mAb的Ig类、亚类及型;用免疫印迹法鉴定mAb的特异性。结果:获得1株可分泌抗人内皮抑素mAb的杂交瘤细胞株4E7,该株杂交细胞分泌的mAb属于IgGl(λ型)。腹水mAb的效价为1×10-4-1×10-6,纯化后大于1×10-10。免疫印迹结果显示,mAb 4E7可特异性地与酵母及大肠杆菌表达的内皮抑素起反应,而与bFGF等其他细胞因子不发生交叉反应。结论:分泌抗人内皮抑素mAb杂交瘤细胞株的建立,为进一步研究奠定了基础。     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

抗环孢菌素A单克隆抗体的制备和特性鉴定

目的:制备环孢菌素A(CsA)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:采用光化学反应制备CsA全抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,以ELISA法对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定。结果:获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞4E1-C4-E12,细胞培养上清效价、腹水效价分别为1∶200和1∶105,为IgG1类,可特异性识别CsA,与其类似物CsC、CsD交叉反应率为13.3%、21.5%。结论:成功地制备了针对CsA的mAb,为进一步研制检测CsA的ELISA试剂盒奠定基础。     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB／c小鼠。待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB／c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western—blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株（N012和N013）可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23（Dusp23）单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：5120和1：2560,腹水效价分别为1：25600和1：12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为IgG1型,轻链均为K型。两株抗体分别与临床肝癌组织标本免疫组化结果均为阳性。结论成功制备两株能特异性识别Dusp23的单克隆抗体,为进一步研究Dusp23的生物学功能,揭示其与肿瘤发生发展之间的关系奠定了基础。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定

目的:制备抗鸡γ-干扰素单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)(pET-ChIFN-γ)表达产物的包涵体作为抗原免疫BALB/c鼠,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测抗原,制备抗鸡γ-干扰素mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和Westernblot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株可稳定分泌抗鸡γ-干扰素mAb的杂交瘤细胞株1G5、5E3,其Ig亚类均为IgG2a,腹水mAb1G5、5E3的ELISA效价分别为1∶1600000,1∶120000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-ChIFN-γ及GST-ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,与未表达这2种IFN-γ的其他8种菌株均不发生反应。在蛋白质印迹试验中,2株mAb均能与融合蛋白GST-ChIFN-γ、His-ChIFN-γ发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb1G5、5E3是针对鸡γ-干扰素的特异性mAb。结论:成功地制备抗鸡γ-干扰素的mAb,它们在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面有应用价值。     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

目的制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白(hAFP)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗hAFP单抗的杂交瘤细胞株;对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析;双抗体夹心ELISA法筛选最佳配对抗体;初步建立DAS-ELISA检测方法并检测血样,绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。结果共获得12株稳定分泌抗hAFP单抗的杂交瘤细胞株,其中Ab 1~Ab 5 5株单抗的腹水效价均高于600万,Ab 5的效价高达3000万;特异性鉴定结果表明Ab 1~Ab 5均能够特异识别天然hAFP分子,但Ab 5与人血清白蛋白(HSA)存在较强交叉反应;抗体配对实验共筛选出5对(Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和Ab 4/HRP-Ab 1)能够满足hAFP检测要求且无交叉反应的配对抗体,最终确定Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2和Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 4为最佳配对组合;利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线,其线性检测范围为5~250 ng/ml,最低检测限2 ng/ml,检测上限400 ng/ml,优于进口试剂盒的线性范围5~200 ng/ml和最低检测限5 ng/ml;样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%(119/120例),阴性血清准确率100%(40/40例)。结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗hAFP单抗均可应用于DAS-ELISA试剂盒的研制,Ab 1和Ab 3适合作为捕获抗体,Ab 2和Ab 4适合作检测抗体;自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒,表明具有商用价值。     

抗人Flt-1单克隆抗体的制备和活性鉴定

目的:制备小鼠抗人血管内皮生长因子受体-1(Flt-1)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法:以重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白为抗原,通过经典的杂交瘤制备和活性筛选方法建立能稳定分泌抗Flt-1蛋白的mAb杂交瘤细胞株。结果:经传统的小鼠腹水型抗体的制备和纯化方法获得了高纯度的抗人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb。ELISA方法测定出该抗体的免疫球蛋白亚型为IgG1,轻链为κ链。West-ern blot结果显示该抗体能特异性地识别重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白,FACS结果表明该抗体能结合到Flt-1阳性的脐静脉内皮细胞和K562/A02细胞表面,并呈现出抗体浓度依赖性。结论:成功建立了1株能够稳定分泌抗重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb细胞株XA12,为今后进一步开展Flt-1及其胞外Ⅲ区蛋白的生物学功能研究以及基因工程抗体研究奠定了基础。     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组人心肌肌钙蛋白I（rhcTnI）的单克隆抗体,并对其单克隆抗体的特性进行鉴定。方法利用纯化后的rhcTn I作为免疫原,常规免疫Balb／c小鼠．取其脾细胞与同系骨髓瘤细胞Sp2／0进行常规融合。用甲基纤维素半固体培养基法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株,利用ELISA、Western blot等方法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果筛选出3株稳定分泌抗rhcTnI的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4B3、7D5和3E6。 3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgGl（4B3、7D5）和IgG2b（3E6）。3株单克隆抗体与rhcTnI发生特异性结合,而与大肠杆菌菌体蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）无特异性交叉反应,3株单克隆抗体的亲和力常数分别为1．76×10^9L／mol、1．43×10^9L/mol和1．04×10^9L/mol。结论获得了效价高、特异性好的抗rhcTnI的单克隆抗体,为cTnI诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

 目的 制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法 以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC -90免疫的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,Giemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果 获得三株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90～110之间;三株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其它组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论 成功制备高效且特异的抗人肺癌单克隆抗体。