CD34+造血祖细胞定向诱导分化为T/NK细胞的研究进展

成熟T/NK细胞具有重要的移植免疫和抗肿瘤免疫效应。利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能,通过体外培养体系(含促进T/NK细胞分化发育的以下成份:如SCF、Flt-3L、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、TNF-α等细胞因子,胸腺肽/胸腺素,胸腺基质细胞等不同组合),定向诱导其分化为成熟的T/NK细胞,可用于造血干细胞移植后的细胞过继免疫治疗。本文就CD34~+造血祖细胞定向诱导分化为T/NK细胞的实验研究的理论基础和进展作一综述。     

CD34^＋造血祖细胞定向诱导分化为T／NK细胞的研究进展

成熟T／NK细胞具有重要的移植免疫和抗肿瘤免疫效应。利用造血干／祖细胞具有多向分化的潜能，通过体外培养体系（含促进T／NK细胞分化发育的以下成份：如SCF、Flt-3L、IL－2、IL-7、IL-12、IL-15、TNF-α等细胞因子，胸腺肽／胸腺素，胸腺基质细胞等不同组合），定向诱导其分化为成熟的T／NK细胞，可用于造血干细胞移植后的细胞过继免疫治疗。本文就CD34^ 造血祖细胞定向诱导分化为T／NK细胞的实验研究的理论基础和进展作一综述。     

CD34^＋造血祖细胞的研究进展

ＣＤ３４抗原是造血祖细胞表面的一个较为特异的抗原；ＣＤ３４抗原在造血祖细胞的分化过程中起着某种调节作用；ＣＤ３４＾＋细胞可以重建并维持机体的正常造血，利用ＣＤ３４抗原的一些单克隆抗体可以富集造血祖细胞，用于造血干细胞移植和基因治疗。本文对ＣＤ３４抗原的生物学特性、ＣＤ３４＾＋细胞的特性及分离检测方法、临床应用进行了综述。     

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化.结果显示10-70μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20μg/ml效果最为明显.结论合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化.     

造血干/祖细胞体外定向诱导分化为粒细胞的研究

为探讨利用人造血干/祖细胞体外定向诱导分化的人粒细胞应用于临床大剂量放，化疗后预防感染的可行性，利用源自人胎盘脐带血的CD34^ 细胞及SCF，IL-3，IL-6和G-CSF的细胞因子组合的培养条件。体外进行向粒细胞的诱导分化。结果表明，在该体系条件下可诱导分化出约1000倍数量的细胞，流式细胞仪检测诱导效率可达60%以上。且诱导分化的细胞染色体未出现异常。裸鼠致瘤实验表明该细胞不具致瘤性。细胞体外生长14-21天为高峰，33天后细胞不再增殖，且诱导分化出的细胞具有吞噬细菌的功能。结论：利用细胞工程的方法体外“生产”出的粒细胞具有应用安全性，且具备生理状态下产生的此种细胞应具备的基本功能。为其临床应用提供了基础。     

骨髓增生异常综合征CD34+造血干祖细胞生物学特征研究进展

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性、克隆性造血干/祖细胞疾病.本文就MDS恶性造血克隆的起源、CD34+造血干/祖细胞增殖动力学异常、凋亡异常及其机制、信号传导异常等作一综述.     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了 Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34＋造血祖细胞。     

造血干/祖细胞体外大规模定向诱导分化及其临床应用前景

体外利用细胞培养技术和不同的细胞因子组合可将造血干细胞定向分化为中性粒细胞、红细胞、巨核细胞以及树突状细胞等细胞成分,利用这一特性可望在体外开发可应用于临床的造血细胞工程产品。本文就造血干/祖细胞体外定向诱导分化的细胞产品及其临床应用的前景进行综述。     

人脐血造血干/祖细胞体外定向诱导分化过程中端粒酶的表达

探讨脐血造血干/祖细胞体外诱导分化过程中端粒酶的表达,为造血干细胞产品的临床应用提供一个监测细胞增殖潜能和安全性的指标。用源自人脐血的CD34~+细胞及不同细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6+G-CSF,SCF+IL-3+IL-6+EPO)在体外进行诱导分化;用TRAP聚丙烯酰胺凝胶电泳法、TRAP-ELISA法检测CD34~+细胞及诱导分化细胞的端粒酶活性;用Western印迹法在蛋白水平检测端粒酶催化亚基hTERT的表达,用RT-PCR在细胞转录水平检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达。结果显示,在体外诱导分化14-21天为细胞生长峰值,细胞总数可增加(1006.4±103.2)倍,随着培养时间的延长,细胞数量不再增加。CD34~+细胞低度表达端粒酶活性和hTERT基因,在细胞诱导分化过程中端粒酶活性及hTERT表达逐渐升高,细胞诱导14天后端粒酶活性及hTERT表达下降,28天端粒酶活性及hTERT基因检测不出。结论:利用CD34~+细胞在体外定向诱导分化出的大量细胞,不具有无限增殖的特性,可安全地应用于临床,且利用端粒酶的检测可为临床应用诱导分化细胞的时机提供依据。     

新一代细胞疗法：造血祖细胞体外扩增与定向诱导分化

第一代细胞疗法是成熟血细胞的全血输注,以后逐渐发展为成分输血。第二代细胞疗法是包括骨髓、动员外周血及脐带血的造血干细胞移植。近年来,体外扩增造血祖细胞的技术方法已逐渐成熟,在液体培养体系中加入FL(Flt-3 ligand),SCF,IL-1,IL-3,GM-CSF,G-CSF,Epo等细胞因子,可使细胞总数及各系祖细胞得以大量扩增,部分技术方法还可明显地扩增原始的早期祖细胞,(LTC-IC,CD34~ CD38~-细胞,CFU-GEMM等),如FL,Epo等细胞因子的组合,CD34~ CD38~-细胞亚群的扩增,负调控因子(如TGF-β,LIF及MIP-1α,IL-8,PF4等趋化因子)的应用,基质细胞的支持和继续灌注培养等。此外,利用上述细胞因子和FL,SCF,G-CSF,Epo,Tpo IL-4,FNF-α,IL-7,IL—15等的不同组合,还可定向地诱导CD34~ 细胞向粒系、红系、巨核系/血小板、NK细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)及淋巴细胞等方向分化与扩增。这些技术方法与方案已开始进入临床试用,在造血调控研究,造血干细胞移殖,大剂量化疗后的造血细胞支持治疗,肿瘤生物免疫治疗,基因治疗等领域将具有广阔的应用前景。     

CD34抗原阴性的造血干细胞

即往研究表明造血干细胞(HSC)存在于CD34~ 的细胞组群中,但最近研究发现在鼠和人体内存在有CD34~-的HSC。本文对CD34~-HSC的认识现况作了一简要的概述。     

成人急性淋巴细胞白血病髓系抗原和CD34表达研究

分析成人急性淋巴细胞白血病的髓系原、ＣＤ３４表达的特点及与Ｐｈ染色体表达,预后的关系。方法采用间接免疫荧光法分析１０２例初治ＡＬＬ患的免疫表型。结论成人ＡＬＬ髓系抗原表达和ＦＡＢ分型有关,与治疗缓解率呈负相关;ＣＤ３４表达与ＡＬＬ亚型,细胞分化程度有关,和治疗缓解率无显关系。     

不同来源CD_（34）~＋CD_（38）~＋和CD_（34）~＋CD_（38）~－细胞群造血性能的不均一性研究

利用ＦＡＣＳ将ＣＤ３４＋细胞分选为ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋和ＣＤ３４＋ＣＤ３８－两个亚群，并比较了来源于人脐带血、骨髓及外周血两个亚群的分布比例和造血性能的差异。结果表明骨髓中ＣＤ３４＋及其亚群细胞所占比例最高，外周血最低；脐带血来源的亚群细胞体外形成各系造血集落及液体培养体系中维持长期造血的能力最强，外周血最弱。从而表明不同细胞亚群造血性能不均一，同一亚群不同来源的细胞也同样具有不均一性。     

不同病期慢性粒细胞白血病CD34阳性细胞的临床意义

用ＡＰＡＡＰ法对３４例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者外周血和（或）骨髓单个核细胞（ＭＮＣ）ＣＤ３４抗原进行检测。ＣＭＬ慢性期、加速期、急变期外周血ＭＮＣ的ＣＤ３４抗原表达阳性率分别为７．２８％±３．５９％（ｎ＝２０），１７．５５％±１．９２％（ｎ＝６）和２１．２５％±８．２５％（ｎ＝８）。慢性期与加速期、急变期相比差异显著（Ｐ＜０．００１）。ＣＭＬ慢性期患者低、中、高危组外周血ＭＮＣＣＤ３４抗原表达阳性率分别为４．０６％±２．０１％（ｎ＝８）．８．３０％±２．１６％（ｎ＝８），１１．６５％±２．３５％（ｎ＝４），差异显著（Ｐ＜０．０５）。ＣＭＬ初诊者外周血ＭＮＣＣＤ３４抗原阳性率较马利兰治疗者高。外周血和骨髓ＭＮＣＣＤ３４抗原的表达无显著性差异     

人胚胎CD34+细胞体外向神经细胞分化的实验研究

目的最近研究显示骨髓干细胞可向多种组织细胞分化、且在细胞移植治疗中具有显著效果.胚胎肝是胚胎中后期的主要造血组织.研究人胚胎肝白细胞抗原34阳性细胞(antigens,CD34+)是否具有向神经组织细胞分化的潜能.方法实验于2003-03/12在暨南大学中心实验室完成.采用磁性活化细胞分选磁珠分离试剂盒从自然流产3月龄活胎的肝脏分离CD34+细胞,以DMEM/F12+100 mL/L胎牛血清培养液培养、传代;第五代细胞待细胞融合达80%后,用1 mmol/L β-巯基乙醇+10-7mol/L维甲酸诱导24 h,磷酸盐缓冲液洗涤,然后在无血清培养基中继续培养.免疫细胞化学检测诱导后的细胞中神经细胞特异蛋白.结果培养的人胚胎肝CD34+细胞经β-ME+RA诱导后,细胞表现神经元样细胞形态,表达神经细胞特异蛋白.统计显示48%细胞nestin染色阳性,91%细胞NSE染色阳性,85%细胞NeuN染色阳性,80%细胞TuJ-1染色阳性,53%细胞NF-M染色阳性.结论人胎肝CD34+细胞在体外能向早期未成熟神经细胞分化;提示CD34+胎肝细胞在神经系统疾病细胞治疗和基因治疗中应用价值.     

关于CD34-造血干细胞的新观点

最近的研究表明CD34-造血干细胞的存在,改变了传统的造血干细胞必须表达CD34抗原的观点.近来大量资料对其功能、与CD34+细胞的关系、表面标志以及基因表达等作了报道,现对此做一综述.     

人胚胎CD34＋细胞体外向神经细胞分化的实验研究

目的：最近研究显示骨髓干细胞可向多种组织细胞分化、且在细胞移植治疗中具有显著效果。胚胎肝是胚胎中后期的主要造血组织。研究人胚胎肝白细胞抗原34阳性细胞(antigens，CD34’)是否具有向神经组织细胞分化的潜能。方法：实验于2003-03／12在暨南大学中心实验室完成。采用磁性活化细胞分选磁珠分离试剂盒从自然流产3月龄活胎的肝脏分离CD34’细胞，以DMEM／F12 100mL／L胎牛血清培养液培养、传代；第五代细胞待细胞融合达80％后，用1mmol／Lβ-巯基乙醇 10^-7mol／L维甲酸诱导24h，磷酸盐缓冲液洗涤，然后在无血清培养基中继续培养。免疫细胞化学检测诱导后的细胞中神经细胞特异蛋白。结果：培养的人胚胎肝CD34’细胞经β-ME RA诱导后，细胞表现神经元样细胞形态，表达神经细胞特异蛋白。统计显示48％细胞nestin染色阳性，91％细胞NSE染色阳性，85％细胞NeuN染色阳性，80％，细胞TuJ—1染色阳性，53％细胞NF-M染色阳性。结论：人胎肝CD34’细胞在体外能向早期未成熟神经细胞分化；提示CD34’胎肝细胞在神经系统疾病细胞治疗和基因治疗中应用价值。     

三种标记法对脐血CD34+造血干细胞绝对计数的比较分析

CD34抗原的相对分子质量为105000～120000，选择性表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面，该抗原在原始造血中表达最强，随着细胸分化、其表达水平逐渐减弱直至消失，因此一直作为干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床。脐带血中含有丰富的造血干/祖细胞，被认为是极具潜力的继骨髓和外周血后的第3种造血干细胞来源。     

三七皂苷对人骨髓CD34+造血干/祖细胞的增殖分化作用

为了探讨三七皂苷 (PNS)对人骨髓CD34+ 造血干 /祖细胞的刺激增殖和诱导分化的作用 ,用DynalM 4 5 0CD34+ 免疫磁珠阳性选择法获取高纯度的人骨髓CD34+ 细胞 ,采用多向祖细胞 (CFU Mix)体外集落培养和流式细胞术检测细胞增殖与分化。结果显示 :经免疫磁珠阳性选择 ,从骨髓细胞收获的CD34+ 细胞获得率为 (1.0 3±0 .74 ) % ,流式细胞术分析纯度达到 86 % - 93%。PNS 10mg/L和 2 5mg/L能刺激CD34+ 细胞增殖 ,使CFU Mix集落生成增加 ,2 5mg/L的PNS对CFU Mix产率提高 (34.7± 16 .0 ) % (P <0 .0 1) ,是促进造血的最适浓度 ;PNS2 5 ,5 0和 10 0mg/L时 ,能诱导CD34+ 细胞向粒系细胞分化 ,粒系表面标记CD33+ 和CD15 + 的细胞百分比均明显高于无PNS的对照组 ,而红系细胞表面标记CD71+ 和G A+ 细胞百分比则无明显变化。结论 :PNS对CD34+ 造血干 /祖细胞不但具有显著的刺激增殖作用 ,而且能够诱导其向粒系细胞定向分化的效应