耐紫杉醇食管鳞癌细胞株Ec9706/P-1的建立及特征

目的：建立人食管癌紫杉醇耐药细胞系Ec9706/P-1并研究其生物学特征,为食管癌临床治疗提供实验依据.方法：小剂量逐步间歇诱导,建立人食管癌紫杉醇耐药细胞系Ec9706/P-1.用MTT法检测该耐药细胞株的多药耐药性及耐药指数,采用流式细胞术进行细胞周期分析.应用罗丹明（Rh123）排出试验定测P-gp功能.采用免疫组织化学方法检测多药耐药蛋白（MDR1）、多药耐药相关蛋白（MRP1）的表达情况.结果：Ec9706/P-1细胞与Ec9706细胞镜下形态无明显差别,体积稍大;Ec9706/P-1生长缓慢（P＜0.05）,倍增时间延长（P＜0.05）,大部分肿瘤细胞集中在G0＋G1期（P＜0.05）;MTT结果显示Ec9706/P-1对PIX的耐药指数为6.68,具有紫杉醇耐药性;Rh123排出试验显示Ec9706/P-1细胞平均荧光强度显著降低;免疫细胞化学方法检测发现Ec9706/P-1多药耐药蛋白（MDR1）表达明显升高（P＜0.05）,多药耐药相关蛋白（MRP1）表达无统计学意义（P＞0.05）.结论：Ec9706/P-1具有明确的耐药性,但耐药蛋白表达不一致,耐药机制复杂,可用于食管癌临床治疗的基础研究.     

NF-κB p65对人非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡调控的研究

目的:研究NF-κB p65对人非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞凋亡的作用及其调控机制。方法:以NF-κB p65抑制剂quinazoline(QNZ)处理人NHL细胞,采用Annexin-Ⅴ染色方法检测肿瘤凋亡水平的变化,蛋白质印迹法检测各细胞系中Survivin蛋白及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达水平;进一步应用实时定量PCR方法检测Survivin mRNA水平。结果:NF-κB p65抑制剂QNZ能够诱导NHL细胞的凋亡(P<0.05),具有时间-剂量依赖性。10nmol/L QNZ作用72h后Namalwa、Ramos和Raji细胞凋亡率分别为(13.5±2.7)%、(16.4±2.8)%和(15.8±2.5)%。抑制NF-κB p65的表达能够显著下调淋巴瘤细胞中Survivin蛋白的表达水平,10nmol/L QNZ作用72h后Namalwa、Ramos和Raji细胞中Survivin蛋白表达为0.58±0.06、0.54±0.03和0.51±0.09。同时,凋亡相关蛋白Bcl-2表达减低而Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2与Bax蛋白比值明显降低,与对照组相比差异均有统计学意义,P<0.05。预处理QNZ后3种NHL细胞Survivin mRNA均不同程度下降,随浓度增加其作用更为明显,P<0.05。结论:抑制NF-κB p65能够诱导NHL细胞凋亡,其机制可能与下调Survivin蛋白表达水平及对凋亡相关蛋白Bcl-2家族的调节有关。     

去甲斑蝥素诱导人食管癌Ec9706细胞凋亡作用及机制研究

目的 研究去甲斑蝥素作用人食管鳞癌细胞Ec9706后细胞凋亡率,并进一步探讨去甲斑蝥素诱导Ec9706细胞凋亡的作用机制,为去甲斑蝥素应用于临床抗癌药物提供基础实验。 方法 不同浓度去甲斑蝥素 (0、5、10、20、40 μg/ml)分别作用Ec9706细胞不同时间(12、24和48h)后MTT方法检测细胞生长抑制率。不同浓度去甲斑蝥素(0、5、10、20 μg/ml) 分别作用Ec9706细胞不同时间(24和48h)后流式细胞术检测细胞凋亡及Caspase-3和Survivin蛋白的表达。结果 MTT结果显示,去甲斑蝥素作用Ec9706细胞后呈现不同程度的细胞生长抑制作用,而且随作用浓度及时间增加细胞生长抑制率呈现显著增高趋势。去甲斑蝥素作用Ec9706细胞后,流式细胞术检测结果显示,Ec9706细胞凋亡率与对照组相比显著增高(P<0.05),Caspase-3蛋白表达量显著增高而Survivin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 去甲斑蝥素具有抑制食管癌Ec9706细胞生长的作用,其作用机制可能与下调细胞Survivin蛋白及上调Caspase-3蛋白表达水平,从而诱导食管癌细胞凋亡有关。     

去甲斑蝥素诱导人食管癌Ec9706细胞凋亡及其可能的机制

目的：研究去甲斑蝥素对人食管鳞癌Ec9706细胞的致凋亡作用及其可能的作用机制,为去甲斑蝥素应用于临床抗癌治疗提供实验依据。 方法：不同质量浓度去甲斑蝥素 (0、5、10、20、40 μg/ml)分别作用Ec9706细胞不同时间(12、24和48 h)后,MTT方法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡及Caspase-3和Survivin蛋白表达的变化。结果：去甲斑蝥素作用后Ec9706细胞呈现不同程度的增殖抑制,而且细胞增殖抑制程度随作用剂量及时间增加不断增强,40 μg/ml去甲斑蝥素作用48 h时,Ec9706细胞增殖抑制率达（80.00±2.15）%。去甲斑蝥素显著诱导Ec9706细胞凋亡,其20 μg/ml作用48 h时,Ec9706细胞的凋亡率达（38.57±1.76）%。去甲斑蝥素作用后,Ec9706细胞中Caspase-3蛋白水平显著增高,而Survivin蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论：去甲斑蝥素明显诱导食管癌Ec9706细胞凋亡,其作用机制可能与下调细胞Survivin蛋白及上调Caspase-3蛋白表达有关。     

MRE11对食管鳞癌细胞凋亡和增殖的作用研究

目的 探讨MRE11对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 MRE11 siRNA转染食管鳞癌细胞,下调MRE11表达;AKT激动剂SC79（0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2 μg/ml）分别孵育24 h;构建过表达载体pcDNA.3.1-c-myc,与MRE11 siRNA共转染细胞;Western blot法检测食管鳞癌细胞Ec9706和TE-1中MRE11、p-AKT和c-myc的蛋白表达量;Annexin-V FITC/PI试剂盒检测Ec9706和TE-1细胞凋亡;Caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性;BrdU方法检测Ec9706和TE-1细胞增殖能力。结果 Ec9706和TE-1细胞中MRE11的蛋白表达较人食管上皮细胞Het-1A明显升高;MRE11 siRNA转染后,Ec9706和TE-1细胞中AKT磷酸化水平及MRE11和c-myc的蛋白表达量显著降低;下调MRE11显著促进Ec9706和TE-1细胞凋亡,提高caspase-3活性,抑制食管鳞癌细胞增殖能力;下调MRE11后,SC79（1.5、1.8和2 μg/ml）显著提高AKT磷酸化水平,同时逆转下调MRE11对c-myc蛋白表达量和细胞增殖的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用。过表达c-myc抑制下调MRE11对细胞增殖的抑制作用和对细胞caspase-3活性的促进作用。结论 下调MRE11可通过调控AKT和c-myc抑制食管鳞癌细胞增殖 及促进细胞凋亡。     

全反式维甲酸诱导食管癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导食管癌EC9706细胞凋亡的作用及其机制。方法用不同浓度的ATRA处理EC9706细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测ATRA对EC9706细胞的增殖抑制效应;采用流式细胞仪和原位末端标记(TUNEL)法检测细胞周期的变化和凋亡率;采用免疫组化S-P法,检测凋亡相关基因caspase-3和bcl-2的蛋白表达,并用病理图像分析软件进行半定量分析。结果ATRA对EC9706细胞有增殖抑制和诱导凋亡的作用;流式细胞仪检测显示,在G1期之前可出现Sub-G1峰,凋亡率最高为(32.6±0.4)%,并有浓度和时间依赖性;TUNEL法显示凋亡小体形成;EC9706细胞在凋亡过程中,凋亡相关基因caspase-3的蛋白表达增强,bcl-2的蛋白表达减弱。结论ATRA作用于食管癌EC9706细胞后将引起细胞凋亡的增加,这主要与ATRA能促进caspase-3的活化,并下调bcl-2的蛋白表达有关。     

苦瓜蛋白在K562/A02细胞生长抑制和凋亡中的作用及其机制研究

目的:研究苦瓜蛋白(momordin)诱导人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02的凋亡及作用机制.方法:采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,FCM法和细胞形态学检测细胞凋亡,FCM法检测P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、p53、bcl-2和caspase-3蛋白表达水平,并运用caspase-8活性检测试剂盒检测caspase-8的活性.结果:苦瓜蛋白能抑制K562/A02耐药细胞的生长且呈剂量依赖关系,并能诱导细胞凋亡,能使P-gp、p53和bcl-2的表达下降,而使caspase-3和caspase-8活性增强.结论:苦瓜蛋白可逆转耐药细胞株K562/A02的细胞凋亡受抑性,主要机制可能与其下调p53、P-gp和bcl-2的表达以及提高caspase活性有关.     

三氧化二砷诱导A375细胞凋亡过程中的信号传导途径研究

背景与目的： 探讨三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)在诱导人黑素瘤A375细胞凋亡中,对NF-κB、C-IAP2以及Caspase-3信号传导途径的影响。 材料与方法： 将As2O3和Caspase-3 抑制剂Ac-devd-cho单独或联合作用A375细胞后,采用Western blot 法检测NF-κB p65和Caspase-3表达水平,免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白的表达,RT-PCR法检测C-IAP2 mRNA表达。 结果： 5.0 μmol/L As2O3单独处理A375细胞12 h和24 h以及As2O3联合Ac-devd-cho处理24 h组,随着As2O3作用时间的延长,Caspase-3激活蛋白增多、NF-κB p65核蛋白和C-IAP2 mRNA表达下降,Ac-devd-cho能够阻断Caspase-3蛋白的活化,而对NF-κBp 65核蛋白和C-IAP2 mRNA表达无明显影响;免疫组织化学法也显示,Caspase-3激活型蛋白随着As2O3作用时间的延长而增高,但能被Ac-devd-cho阻断。 结论： As2O3可诱导A375细胞凋亡,能抑制A375细胞NF-κB、C-IAP2基因的表达,且不被Ac-devd-cho所阻断; As2O3能活化Caspase-3蛋白表达,而此效应可被Ac-devd-cho阻断。推测NF-κB-C-IAP2-Caspase-3通路可能是As2O3诱导A375细胞凋亡的途径之一。     

抗高迁移率族蛋白1中和抗体对肝癌细胞BEL-7402/ADM药物敏感性的影响

目的:探讨抗高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1,HMGB1）中和抗体对肝癌细胞药物敏感性的影响及可能机制。方法:采用阿霉素（adriamycin,ADM）小剂量持续诱导法建立肝癌细胞耐药细胞株BEL-7402/ADM。实验分为BEL-7402/ADM组、ADM组及ADM+抗HMGB1中和抗体组,MTT法检测细胞对ADM的敏感性及抗HMGB1中和抗体对细胞的低毒性,Annexin V-FITC流式细胞法检测细胞凋亡情况,酶标法检测Caspase-9、Caspase-3活性,Western-blot方法检测核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）亚单位p-p65、Bcl-2蛋白的表达。结果:ADM对亲本株的半数抑制浓度(IC50)为0.23 μg/mL,对肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM的IC50上升至4.07 μg/mL,耐药指数为17.7。联合抗HMGB1中和抗体能明显提升ADM对BEL-7402/ADM细胞增殖抑制率,IC50下降至0.91 μg/mL;加用逆转浓度（19 ng/mL）的抗HMGB1中和抗体组的BEL-7402/ADM细胞凋亡率较单用ADM组的凋亡率明显上升（P＜0.01）。与BEL-7402/ADM组相比,ADM组细胞的Caspase-9、Caspase-3活性有一定程度上升（P＜0.01）,联合抗HMGB1中和抗体作用后,Caspase-9、Caspase-3活性增强则更加明显（P＜0.01）。BEL-7402/ADM组及ADM组间p-p65、Bcl-2表达无显著差异（P＞0.05）,加用抗HMGB1中和抗体处理后,细胞p-p65、Bcl-2表达明显下降（P＜0.01)。结论:抗HMGB1中和抗体对BEL-7402/ADM细胞耐药性有逆转作用,其机制可能与下调NF-κB介导的Bcl-2表达,促进肝癌细胞凋亡有关。     

EGCG通过下调Bcl-2、NF-κB(p65)表达,活化Caspase-3诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对人胃癌SGC7901细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用,探讨EGCG诱导移植瘤细胞凋亡作用的分子机制. 方法:建立人胃腺癌(SGC7901)细胞裸鼠异种移植瘤模型,用不同剂量的EGCG进行治疗,并设对照;采用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,Western blot法检测肿瘤组织凋亡相关基因NF-κB(p65)、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况. 结果:EGCG对移植瘤生长有明显抑制作用;TUNEL法发现EGCG导致移植瘤内细胞发生凋亡;Western blot分析表明EGCG能下调NF-κB(p65)蛋白的表达,促使Bax/Bcl-2蛋白表达的比值增高,并且可以促进Caspase-3的活化. 结论:EGCG对人胃癌细胞裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,并能诱导移植瘤细胞凋亡.其机制可能与通过NF-κB(p65)的下调,促使Bax/Bcl-2比值增高,进而导致Caspase-3的活化而诱导细胞发生凋亡相关.     

缺氧微环境中Bcl-2干扰对食管癌Ec9706细胞血管生成拟态的影响

目的 探讨缺氧微环境对食管癌Ec9706细胞血管生成拟态的影响及其可能的分子机制。方法 应用CoCl2化学法诱导人食管癌细胞形成缺氧微环境,在缺氧微环境中以Bcl-2-siRNA干扰人食管鳞癌细胞系Ec9706,三维培养体系模拟人体内环境并置于荧光倒置显微镜下观察管道结构形成数量及形态。流式细胞术检测干扰前后细胞的增殖情况,采用RT-PCR法和Western blot法检测Bcl-2、VEcadherin(VE-cad)及MMP2的mRNA及蛋白表达情况。结果 缺氧对照组比常氧对照组形成更多的网络样管状结构（P＜0.000）,凋亡减少（P＜0.05）,Bcl-2、VE-cad和MMP2的mRNA和蛋白表达较常氧下显著增多（P＜0.05）。而在缺氧培养下进行Bcl-2-siRNA干扰后,缺氧实验组对比缺氧对照组网络样管状结构显著减少（P＜0.000）,凋亡增多（P＜0.05）, 而Bcl-2、VE-cad及MMP2的mRNA和蛋白表达也较缺氧对照组细胞的表达显著降低（P＜0.05）。缺氧空载体组与缺氧对照组网络样管状结构未见明显差异（P＞0.05）,凋亡率差异未见统计学意义（P＞0.05）,Bcl-2、VE-cad和MMP2的mRNA和蛋白表达两组之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论 缺氧能够诱导食管癌Ec9706细胞血管生成拟态的形成,且Bcl-2依赖的VE-cad过表达可能是缺氧诱导血管生成拟态形成的重要分子机制。     

NKX6.3对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及作用机制

目的 探讨NKX6.3对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及可能的作用机制。方法 人食管癌EC9706细胞分别转染NKX6.3（NKX6.3组）和空白质粒（miR-NC组）,设空白对照组（Control组）。CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞内活性氧、线粒体膜电位及细胞凋亡情况,Transwell 法检测细胞侵袭能力,Western blot检测增殖相关蛋白Ki67、侵袭相关蛋白（Vimentin、E-cadherin及N-cadherin）,凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表达。结果 Control组、miR-NC组和NKX6.3组食管癌EC9706细胞中NKX6.3表达、细胞增殖能力、细胞内活性氧、线粒体膜电位、细胞凋亡及侵袭能力,以及Ki67、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.01）。其中,NKX6.3组NKX6.3表达量、细胞内活性氧,细胞凋亡率,Vimentin、E-cadherin、Bax及Caspase-3蛋白表达水平较miR-NC组升高;而线粒体膜电位、细胞增殖率、细胞侵袭数目、N-cadherin及Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.01）。结论 NKX6.3可抑制食管癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,该作用可能通过调控食管癌细胞中的增殖凋亡相关蛋白表达及活性氧水平实现。     

沉默或抑制TAK1表达能够通过NF-κB信号通路改善卵巢癌细胞的紫杉醇耐药性

目的:探究利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)或转化生长因子 β活化激酶1[transfor-ming growth factor-β(TGF-β)-activated kinase 1,TAK1]抑制剂5 Z-7-oxozeaenol进行靶向沉默或抑制TAK1表达对卵巢癌细胞紫杉...     

NF-κBp65对食管鳞癌细胞上皮间质转化的影响*

目的:探讨NF-κ Bp65对食管鳞癌细胞EC9706上皮间质转化的影响。方法:NF-κ Bp65反义寡核苷酸（NF-κBp65-ASODN ）转染食管鳞癌细胞EC9706,采用RT-PCR、免疫细胞化学及流式细胞术检测NF-κ Bp65-ASODN 转染前后EC9706细胞中NF-κ Bp65、上皮性标志物E-cadherin 及间质性标志物Vimentin mRNA 及蛋白表达的变化,观察转染前后细胞形态学的改变,细胞划痕实验检测转染前后细胞运动能力的变化。结果:转染NF-κ Bp65-ASODN 的EC9706细胞,其NF-κ Bp65mRNA（0.14±0.06）及蛋白（免疫细胞化学:11.33± 1.40% ,流式细胞术:11.78%）的表达低于转染前（mRNA :0.45± 0.05;蛋白:免疫细胞化学:17.17± 1.66% ,流式细胞术:15.76%）（P<0.05）,上皮性标志物E-cadherin mRNA（0.36± 0.08）及蛋白（免疫细胞化学:17.58± 1.86% ,流式细胞术:14.98%）的表达高于转染前（mRNA :0.22± 0.06;蛋白:免疫细胞化学:14.42± 1.63% ,流式细胞术:12.22%）（P<0.05）,间质性标志物Vimentin mRNA（0.75± 0.07）及蛋白（免疫细胞化学:16.00± 1.41% ,流式细胞术:12.90%）的表达低于转染前（mRNA :0.89± 0.09;蛋白:免疫细胞化学:19.50± 0.89% ,流式细胞术:17.76%）（P<0.05）。 转染NF-κ Bp65-ASODN 后,EC9706细胞形态发生改变,细胞迁移距离（0.45± 0.08）较转染前（0.81± 0.11）明显缩短（P<0.05）。 结论:NF-κ Bp65可能参与食管鳞状细胞癌的上皮转化。NF-κ Bp65-ASODN 转染可抑制食管鳞癌细胞上皮间质转化,上皮性标志物E-Cadherin 表达上调、间质性标志物Vimentin 表达下调,且细胞形态发生改变、细胞运动能力降低。      

EphB1通过PI3K/AKT信号通路促进食管鳞状细胞癌EC-9706细胞增殖、迁移、侵袭并抑制其凋亡

目的:研究促红细胞生成素产肝细胞受体B1(erythropoietin-producing human hepatocellular receptor B1,EphB1)对食管鳞状细胞癌EC-9706细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响,并探索其可能的作用机制。方法:qRT-PCR法分析40对食管鳞状细胞癌手术患者的癌组织及邻近正常组织中EphB1表达情况,并分析其临床特征。在EC-9706细胞中分别转染si-EphB1 RNA和oe-EphB1 RNA及其阴性对照。通过qRT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测转染效率;CCK-8实验分析EphB1对细胞活力的影响;Hoechst 33258染色和流式细胞学实验检测细胞凋亡;划痕愈合实验及Transwell侵袭实验明确细胞迁移及侵袭能力;蛋白免疫印迹实验检测EphB1蛋白、增殖相关蛋白［增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）］、凋亡相关蛋白［Bad、Bcl-2、Caspase 3 及剪切型-Caspase 3（cleaved-Caspase 3）］、侵袭转移相关蛋白［基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、Snail、波形蛋白(Vimentin)、N-cadherin、E-cadherin］以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白（PI3K、AKT、p-AKT）的表达水平。结果:EphB1在食管鳞状细胞癌组织及细胞系中高表达(P均＜0.05),EphB1的表达水平与食管鳞状细胞癌患者的TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移具有显著相关性(P均＜0.05)。与对照组相比,通过细胞转染技术沉默EphB1和过表达EphB1使EC-9706细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显降低或增强,并诱导或抑制细胞凋亡(P均＜0.05)。在蛋白水平上,si-EphB1和oe-EphB1处理EC-9706细胞48 h后,增殖相关蛋白PCNA蛋白表达水平分别显著降低或增加（P均＜0.05）,并分别增加或降低促凋亡相关蛋白Bad、cleaved-Caspase 3的表达水平（P均＜0.05）,下调或上调抗凋亡蛋白Bcl-2、Caspase 3的蛋白表达（P均＜0.05）,抑制或促进侵袭转移相关蛋白MMP-9、MMP-2、Snail、Vimentin、N-cadherin的蛋白活性,但却上调或下调 E-cadherin的表达水平（P均＜0.05）。同时,Western blotting实验结果还证实EphB1可诱导食管鳞状细胞癌EC-9706细胞中通路蛋白PI3K、p-AKT的活性增强（P均＜0.05）。结论:EphB1可能通过调控PI3K/AKT信号通路促进食管鳞状细胞癌EC-9706细胞的增殖、迁移及侵袭,并抑制其凋亡。     

LRRK2在乳腺癌细胞增殖和耐药中的作用及其机制研究

目的:探讨LRRK2在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞增殖、凋亡及耐药的作用和分子机制.方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测了48例乳腺癌组织及其配对正常组织中LRRK2表达;并检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、BT-483及阿...