手足口病病原液相芯片检测方法的建立

目的：建立检测手足口病病原的液相芯片方法。方法：设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针和荧光编码微球进行偶联,制备液相芯片;将样本核酸多重PCR扩增产物与液相芯片进行杂交,并通过液相芯片检测仪读取检测结果。结果：同时检测多种肠道病毒（EV）,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CAV16）的病毒核酸最低检出量均为1pg,检测特异性高。与参照方法相比,EV、EV71、CAV16的检测灵敏度分别为：91．4％、92．9％、100．O％,检测特异度分别为100．0％、97．1％、98．2％,检测准确度分别为：100．0％、96．3％、87．5％。结论：构建的检测手足口病病原的液相芯片方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,为手足口病的快速诊断奠定了基础。     

2009-2015年西北地区5岁以下儿童发热伴出疹症候群病原及流行病学特征分析

目的 通过对西北四省区发热伴出疹症候群的监测,了解5岁以下儿童发热伴出疹症候群的病原构成及流行特征,为疾病监测及预防控制提供参考。方法 采用描述性流行病学方法分析5岁以下儿童发热伴出疹症候群的病原及流行病学特征,数据为国家传染病监测技术平台信息管理系统2009-2015年甘肃、青海、内蒙古和新疆四省区发热伴出疹症候群哨点医院的监测数据。结果 西北四省区5岁以下儿童发热伴出疹症候群病原构成以病毒为主,依次是肠道病毒、麻疹病毒、水痘病毒和风疹病毒等;各年龄段病原构成显示0~岁组病原构成主要是麻疹病毒,1~5岁组主要是肠道病毒;肠道病毒分型结果显示,肠道病毒71型（human enterovirus 71,EV71）占肠道病毒阳性病例数的47.18%,柯萨奇A16型（coxsackie A16,CA16）占45.59%;季节特征显示,肠道病毒阳性病例分布主要集中在每年的5~7月,麻疹病毒阳性病例分布主要集中在每年的3~5月。结论 西北地区5岁以下儿童发热伴出疹症候群病原构成以病毒为主且具有明显的季节特征,应加强麻疹、手足口等疾病的监测和预防控制工作。     

基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法的建立

目的建立基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法。方法建立探针偶联至荧光微球、多重PCR扩增方法、杂交检测方法,并对所建立的液相芯片检测方法的灵敏度和特异性进行评价。结果建立的液相芯片检测方法能对基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒中的任意1种、任意2种或者3种同时进行筛查检测,基孔肯亚热病毒检测的灵敏度为1×104copies/PCR,克里米亚-刚果出血热病毒检测的灵敏度为1×105copies/PCR,裂谷热病毒检测的灵敏度为1×103 copies/PCR。该方法对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒的检测结果均为阴性。结论该方法具有高通量、多重检测、快速、敏感、特异的特点,为基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒的筛查检测提供一种新方法。     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP）,以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。     

多重荧光RT-PCR方法检测手足口肠道病毒方法的研究

目的为了解手足口病的流行和感染情况,并进行快速准确的检测。方法本研究建立了含非竞争性内标的同时检测肠道病毒通用型、肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒CA16型的四重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评价,并对多份临床样本进行了应用检测。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行了检测,显示了良好的特异性;该检测方法对EV71型和CA16型的检测灵敏度分别达到31.25 TCID50和1.25×102TCID50;将浓度为1×104TCID50及5×102TCID50的EV71样本进行重复性实验,其变异系数均小于1.5%;将浓度为5×102～5×105TCID50的EV71和CA16样本进行定量范围实验,其相关系数R2值在0.982～0.998之间。采用本研究建立的方法检测40份疑似临床样本,最后检出31份肠道病毒阳性样本,检出率为77.5%,其中8例为EV71型阳性,13例为CA16型阳性。另外,实验数据表明内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。结论本方法能同时快速检测所有肠道病毒并进行EV71型及CA16型的分型,并且灵敏度高、特异性好、扩增效率高,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。     

荧光PCR法检测手足口病病原体及其临床意义

目的 探讨荧光定量PCR法对手足口病病原学诊断价值,以便为临床提供简便易行的实验室方法.方法 采集75份具有典型临床表现手足口病患者的便标本,提取病毒RNA,采用荧光定量PCR法进行肠道病毒筛选,及肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A组16型(CA16)的检测,并结合临床诊断进行比较分析.结果 手足口病患者的75份便标本中,共检测出肠道病毒核酸阳性73份,检出率为97.3％,CA16核酸阳性11份,EV71核酸阳性49份,肠道病毒核酸阳性且CA16和EV71核酸均阴性18份;EV71与CA16感染病例的临床表现相似,主要为发热、口腔溃疡和皮疹.结论 发病早期采集粪便用荧光PCR法进行手足口病病原体检测有助于及时作出手足口病的病原学诊断,且是一种简单易行的方法.     

改良石墨烯检测体系对手足口病常见病毒的快速检测

目的 推动临床手足口病的早期诊断,实现对导致手足口病2种常见病毒的快速检测。方法 本研究利用氧化石墨烯对荧光淬灭和DNA特异结合特点,在氧化石墨烯中加入2种不同荧光标记的FDNA,通过创造性的引入解旋酶和ATP提高检测体系的灵敏度,构建双重RecQE + ATP - FDNA - BDNA - GO检测体系,并对该体系中解旋酶和ATP最适使用浓度进行优化。结果 在不经过PCR扩增情况下,将所构建的石墨烯检测体系成功用于体外柯萨奇病毒CA16和肠道病毒EV71特异性的检测。本研究通过对传统石墨烯检测体系的改进和优化,优化后的检测体系对CA16 - cD NA和EV71 - cDNA的检测下限分别0.36 nmol/L和0.29 nmol/L。结论 所构建的检测体系可将柯萨奇病毒CA16和肠道病毒EV71的检测时间缩短至2 h,对临床手足口病的及时诊断预防有重要的借鉴意义。     

同时检测八种HCV亚型的方法研究

目的建立丙型肝炎病毒八种亚型的液相芯片分型检测方法。方法通过建立多重PCR扩增、核酸探针偶联及杂交检测方法,建立液相芯片分型检测方法,并评价所建立的方法。结果建立的基于液相芯片技术的丙型肝炎病毒分型检测方法能对八种亚型进行检测和分型,具有较高的特异性和敏感性。对142份临床样本的检测结果表明,该方法具有高通量、快速、敏感、特异的特点。结论本研究建立的方法能实现对丙型肝炎病毒八种亚型的同时快速检测,是丙型肝炎病毒分型检测的一种新方法。     

EV71、CA16和肠道病毒通用型三重荧光RT-PCR检测技术的建立

目的建立一种可以同时检测EV71、CA16和肠道病毒通用型的三重荧光RT-PCR检测方法,为手足口病监测与应急诊断提供高通量快速检测技术。方法分别在VP1和5’UTR基因保守区设计EV71、CA16和肠道病毒通用型的特异性检测引物以及Taqman探针,建立并评估三重荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性,并对91份疑似手足口病患儿临床标本进行核酸检测与效果验证。结果建立的三重荧光RT-PCR技术可同时对EV71、CA16和肠道病毒通用型进行特异性检测区分,敏感性均可达到0.1 TCID50/m L,从核酸提取至完成检测仅需2~3 h。91份疑似手足口病患儿临床标本采用三重荧光RT-PCR方法检测,EV71、CA16和其他型别肠道病毒的检出率分别为30.77%、9.89%和5.49%;荧光RT-PCR方法的检出率高于培养分离法。结论建立的三重荧光RT-PCR技术能同时准确分型EV71、CA16和其他型别肠道病毒。     

多重荧光逆转录PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

目的建立多重荧光逆转录PCR（RT-PCR）同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法。方法在肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型VP1基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化多重荧光RT-PCR反应体系,评价所建多重荧光RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于临床样品检测。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测具有高度特异性,检出限分别为0.1 TCID50和1 TCID50,具有较好的稳定性,可直接应用于临床样品的检测。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR可以同时准确检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的新方法。     

常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用

目的采用xMAP液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、沙门菌侵袭性基因ssaR、副溶血弧菌通用基因toxR、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因、创伤弧菌的vvh基因和空肠弯曲菌的gyrA基因,设计特异性引物和探针,利用上游引物和生物素标记的下游引物对7个靶序列进行不对称实时PCR扩增,7重实时PCR扩增产物和制备的7种偶联探针的微球在同一体系中进行杂交,最后利用藻红蛋白和生物素的亲和作用报告荧光,从而建立7种食源性致病菌的xMAP液相悬浮芯片检测法。结果 xMAP液相悬浮芯片体系检测140株菌株,均出现特异性荧光中值信号,7种食源性致病菌检测互不干扰。DNA和菌液检出限分别为1～100ng和105～108cfu/ml对56份各类食品标本进行检测,检出金黄色葡萄球菌2份、沙门菌4份、副溶血弧菌7份、单增李斯特菌1份、创伤弧菌3份,未检出大肠杆菌O157∶H7和空肠弯曲菌,此结果与传统方法分离结果相一致。结论xMAP液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右,该方法可应用于食品安全风险监测中食源性致病菌的快速筛查和食源性致病菌的分型鉴定。     

DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因型

目的 制备检测HBV基因型的DNA芯片并进行杂交验证.方法 设计多条HBV分型寡核苷酸探针,固定于醛基基片的特定位置,制备成芯片,采用酶呈色技术(BCIP/NBT显色)检测杂交信号,进行杂交验证分析.结果 106例临床样本均测出基因型,其中B型37例,C型69例;对所有样本进行测序分析,结果与芯片杂交一致,杂交的灵敏度和重复性等指标均佳.结论 DNA芯片检测HBV基因型,操作简便易行,技术要求不高,适于临床推广应用.     

2008年商丘市手足口病病原特征分析

目的了解商丘市手足口病病原特征,填补商丘市该病的本底资料,为科学防治手足口病提供依据。方法对120份手足口病标本进行EV71、CA16及其它手足口病肠道病毒PCR检测。结果阳性人数34人,占38.2%(34/89),其中EV71阳性人数18人,CA16阳性人数1人,其它肠道病毒阳性人数15人。结论商丘市2008年手足口病病原体以EV71为主。     

一步法三重荧光PCR检测手足口病病毒方法的建立及其运用

目的 建立一种三重荧光PCR检测手足口相关病毒的方法,并对收集的样本进行检测.方法 分别用普通PCR和单荧光PCR进行引物探针的测试,然后将确定的引物和探针混合进行三重荧光PCR测试和标本的检测.结果 建立了一种三重荧光PCR方法,利用该方法对94份标本进行检测,其中肠道病毒71型(EV71) 37.23％,科萨奇病毒A16(COX A16) 35.11％,其他肠道病毒4.26％.结论 本研究建立的三重荧光PCR可以特异地检测出引起手足口病的EV71和COX A16以及其他肠道病毒.     

多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒方法的建立与应用

目的建立多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒的方法,以便及时监测并快速诊断急性病毒性呼吸道感染。方法参照NCBI数据库病毒核酸序列设计多重PCR引物,优化反应条件,并对392份儿童呼吸道标本进行检测,验证多重PCR反应的敏感度及特异性。结果采用多重PCR引物对人博卡病毒(h BOV)、KI多瘤病毒(KI)、腺病毒(Ad V)、WU多瘤病毒(WUPy V)、人细小病毒B19(HPVB19)5种DNA病毒进行扩增,分别获得404、324、248、77、128 bp片段,均无非特异性扩增条带,与设计相符;392份儿童呼吸道标本多重PCR扩增出190阳性标本,阳性率为48.46%(190/392),6个月~3岁以内婴幼儿阳性率70.00%(112/160)为最高。结论本研究初步建立了应用多重PCR技术快速检测儿童呼吸道标本中DNA病毒敏感性、特异性好的方法,6个月~3岁以内婴幼儿检出率高。     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。