结直肠癌患者血清可溶性E选择素的检测及其临床意义

目的测定结直肠癌患者可溶性E选择素(sE-selectin)的血清水平并探讨其临床意义。方法采用ELISA法检测84例结直肠癌患者和30名正常人血清sE-selectin水平,随访其中54例患者,比较其手术前后血清sE-selectin水平的变化,并对结直肠癌患者sE-selectin、CEA、CA199和CA242的阳性率进行比较。结果84例结直肠癌患者血清sE-selectin阳性率为71·4%,其水平为55·21±8·98ng/ml,明显高于正常人群(17·94±5·53ng/ml,P<0·001),DukesD期患者sE-selectin水平为75·43±8·67ng/ml,显著高于A、B、C期水平(P<0·01);sE-selectin水平与年龄、性别、肿瘤部位及组织学分级无明显相关(P>0·05)。13例结直肠癌肝转移患者血清sE-selectin水平明显高于无肝转移患者(P<0·01)。结直肠癌患者术后1、12个月及12月以上血清sE-selectin水平同术前比较有显著差异(P<0·001)。sE-selectin阳性率明显高于CEA、CA199、CA242及CEA CA199 CA242联合检测的阳性率(P<0·01)。sE-selectin水平升高组较水平正常组肿瘤患者生存率显著降低(P<0·01)。结论sE-selectin在结直肠癌中阳性率较高,动态检测sE-selectin水平对于预测复发转移、评估预后具有重要临床意义,血清sE-selectin可能成为结直肠癌及其肝转移有价值的标志物。     

急性心肌梗死年轻患者血清可溶性E-选择素的测定意义

目的 :通过测量年轻人急性心肌梗死患者血清可溶性E -选择素 (sCD6 2E)水平的变化 ,探讨其发病机理。方法 :应用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测sCD6 2E水平。结果 :各组不同性别之间sCD6 2E水平无明显差异 (P >0 .0 5 )。与年轻对照组相比 ,年轻人AMI组血清sCD6 2E水平明显增高 ,两组间具有显著性差异 (P <0 .0 1)。与中老年AMI组相比 ,年轻人AMI组血清sCD6 2E水平较低 ,两组间具有差异 (P <0 .0 5 )。结论 :sCD6 2E与年轻人AMI的发生有一定关系。     

大鼠慢性支气管炎模型白细胞L—选择素mRNA的表达及皮质激素对 …

细胞粘附分子（ＣＡＭＳ）是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互粘附的糖蛋白。选择素主要介导白细胞与血管内皮细胞的最初粘附及沿血管壁滚动的过程。本实验采用原位杂交法［１］，检测大鼠慢性支气管炎模型支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）白细胞Ｌ－选择素的表达，及皮质激素对其表达的影响。１材料与方法１．１大鼠慢性支气管炎模型的制备及分组雄性ＳＤ大鼠（军事医学科学院实验动物中心提供）２８只，体重（２２０±３０）ｇ，鼠龄１２周。随机分为：①慢性支气管炎模型组（慢支炎组）：７只，用１％戊巴比妥钠（５０ｍｇ／ｋｇ）…     

5—脱氧杂氮胞苷诱导肝癌细胞E—Cadherin表达增强

目的：研究5－脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株SMMC－7721中E－Cadherin基因表达的影响及其机理。方法：肝癌细胞株SMMC－7721用5－脱氧杂氮胞苷处理,处理前后采用流式细胞仪检测E－Cadherin基因的蛋白表达,观察克隆形成及裸鼠生的变化。结果：经5－脱氧杂氮胞苷处理后,肝癌细胞株SMMC－7721中E－Cadherin蛋白表达增加了43．1％,克隆小而少,裸鼠致瘤性降低。结论：E－Cadherin 基因蛋白表达增高可能与DNA甲基转移酶抑制剂5－脱氧杂氮胞苷抑制了E－Caclherin启动子区域的高甲基化有关,并在一定程度上恢复了其抑癌功能。     

变应性皮炎患者血清中可溶性E-选择素及总IgE检测

目的探讨变应性皮炎血清标志物间的相互关系.方法应用酶联免疫吸附测定法检测了20例变应性皮炎、18例荨麻疹患者及20例正常人对照血清中可溶性E-选择素,同时应用不同方法测定了其血清总免疫球蛋白E及嗜酸细胞阳离子蛋白.结果变应性皮炎患者血清中可溶性E-选择素及总免疫球蛋白E水平非常显著高于对照组(P＜0.001),且可溶性E-选择素与总免疫球蛋白E间具有显著相关性(γ=0.068,P=0.003);变应性皮炎患者血清中嗜酸细胞阳离子蛋白也有升高.上述血清标志物水平在治疗后降低.结论可溶性E-选择素可能是变应性皮炎严重性及活动性的良好标志物.     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

我国登革2型病毒43株PrM—E基因的构建及其在哺乳动 …

目的：构建我国登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法;采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术的构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ的信号肽序列,完整的ＰｒＭ蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％,Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

经皮冠状动脉血运重建术对稳定性心绞痛患者血浆可溶性P选择素的影响

经皮冠状动脉血运重建术（percutaneous coronary intervention,PCI）会损伤冠状动脉内皮,从而有可能激活内皮细胞和血小板,导致一系列炎症反应和急性或亚急性血栓形成。可溶性P选择素存在于血小板α颗粒和内皮细胞Weibel-Palade体中,可能在启动炎症反应,介导白细胞在内皮上黏附和聚集中发挥重要作用。研究表明可溶性P选择素水平在急性冠状动脉综合征患者明显升高,在稳定性心绞痛患者中较低,但仍比冠状动脉造影正常者高。本研究旨在通过P选择素水平观察PCI对冠状动脉内皮的损伤程度以及常规抗血小板治疗对血小板活化的抑制作用。     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

戊型肝炎病毒研究进展

戊型肝炎是一种类似于甲型肝炎的急性病毒性疾病。介绍了戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）在基因结构、基因变异、抗体和ＲＮＡ检出以及疫苗基础研究中的重要进展。     

抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的：表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人．鼠嵌舍抗体。方法：用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因，克隆人IgG1恒定区基因组基因，构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL，pcDNA3、1H，共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达，MTX加压筛选表达量高的克隆，扩大培养收集上清并纯化，纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论：在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体，为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

我国散发性戊型肝炎病毒核苷酸和氨基酸序列测定

报道了我国北京和广州地区散发性戊型肝炎病毒核苷酸和氨基酸序列的测定结果。采集北京、广州两地１９９３年散发的戊型肝炎病人急性期血清，取抗－ＨＥＶ阳性的血清抽提病毒ＲＮＡ，用ＨＥＶ ＥＴ１．１保守区中的特异引物反转录合成ｃＤＮＡ，再用两对引物进行套式聚合酶链反应序列。     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。