ADAMTS13的结构、功能及其与TTP诊疗的关系

血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS 13）是一种能够特异性裂解血管性血友病因子（vWF）的血浆金属蛋白酶,严重的ADAMTS13活性缺失可导致特发性血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发生.本文简要综述了ADAMTS13的结构和功能及其与TTP的发病机制、诊断和治疗之间的关系.     

无流体剪切力条件下ADAMTS13裂解内皮细胞上特大血管性血友病因子的研究

目的：研究血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）在无流体剪切力下裂解内皮细胞上特大血管性血友病因子（ULVWF）的分子机制,为探明血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和其他血栓性疾病的发病机理提供理论依据。方法：通过免疫荧光显微镜观察ADAMTS13在无流体剪切力下裂解内皮细胞表面上ULVWF的情况,采用ELISA测定不同条件下培养基中VWF抗原量的变化。ELISA和Western blot分别测定有无流体剪切力或凝血因子VIII(FVIII)条件培养基中的VWF和蛋白水解片段的数量。多聚体分析评估ADAMTS13裂解内皮细胞上ULVWF的情况。将组胺刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与ADAMTS13和各种N-和C-末端截断的突变体一起孵育,通过免疫荧光显微镜观察与细胞保持结合的ULVWF,ELISA测定内皮细胞释放出的ULVWF,确定降解内皮细胞上ULVWF所需的ADAMTS13结构域。结果：在无流体剪切力下,重组ADAMTS13和血浆ADAMTS13迅速降解了内皮细胞表面上新形成的ULVWF。ULVWF的蛋白水解过程依赖于培养时间、ADAMTS13浓度和剪切力。ADAMTS13...     

在治疗的血浆制品中ADAMTS13活性的比较和稳定性

背景：血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的患者通常缺乏血管性假血友病因子（VWF）裂解酶-ADAMTS13。TTP的基本治疗是血浆置换疗法（TPE），利用多种血浆制品帮助恢复ADAMTS13活性。然而，有多种置换制品可供选择。解冻的血浆制品具有依据产物类型的可变致冷保存期；保存在1C～6C的解冻制品中ADAMTS13的稳定性尚未被确定。     

冷沉淀中血管性血友病因子含量测定及意义

目的通过检测冷沉淀中血管性血友病因子(vWF),并与新鲜冰冻血浆和冷上清比较,为评价冷沉淀质量和临床应用提供依据。方法应用酶联免疫吸附法检测无偿献血者新鲜冰冻血浆、冷沉淀和冷上清中vWF含量。结果新鲜冰冻血浆、冷沉淀和冷上清中vWF表达水平分别为(126.47±7.80)%、(268.50±19.51)%和(19.92±2.34)%。其中冷沉淀组明显高于新鲜冰冻血浆和冷上清。结论在严格控制制备条件下,冷沉淀中富含vWF,冷上清中残留的vWF很低,临床应用时,应该予以区别后选择使用。     

去冷沉淀血浆中部分凝血因子及总蛋白的质量分析

目的 调查分析去冷沉淀血浆(CRP)中部分凝血因子及总蛋白的实际含量,为临床输注提供实验依据.方法 抽取40份新鲜全血,按照标准操作规程制备新鲜冰冻血浆(FFP)和CRP,同一人份制备的血浆分为FFP组(n=40)和CRP(n =40)留样,检测2组标本的FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅤⅢ∶C、FⅨ∶C、Fg和总蛋白含量的变化.结果 CRP组和FFP组的FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、Fg、总蛋白含量比较:(88.8±27.1)％vs(93.2±29.7)％、(23.0±17.4)％vs(83.4±25.8)％、(57.3±12.6)％vs(66.9±12.2)％、(157.7±52.5) 1mg/dLvs(212.6±50.0) mg/dL、(58.5±6.3) g/L vs (67.0±3.5) g/L(均为P＜0.05);FⅤ∶C(％)比较,131.0±49.4 vs 134.7±41.7(P ＞0.05).结论 CRP中的大部分凝血因子活性和总蛋白含量均下降,故临床输注不能等同于FFP和普通血浆.     

制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆的质量优化

目的比较不同保存时间、保存温度、速冻效果对新鲜冰冻血浆纤维蛋白原(FIB)、Ⅷ因子(FⅧ)的影响,选择最佳条件用于制备冷沉淀的原料血浆。方法 (1)以采血时间为时间起点,选取46例4℃保存6~≤8h、8~≤10h、10~≤12h、12~≤14h、14~≤16h、16~≤18h新鲜冰冻血浆检测FIB、FⅧ并分析合格率。(2)以采血时间为时间起点,选取46例4℃保存6~8h、22℃ 6~8h、22℃8~≤10h新鲜冰冻血浆检测FIB、FⅧ的含量并分析合格率。(3)选取29例新鲜冰冻血浆检测速冻前后FIB、FⅧ的含量并分析合格率。结果 (1)随保存时间的延长,4℃条件下FIB、FⅧ的含量、合格率呈下降趋势,FⅧ下降在12~≤14h开始显著变化(P0.05),FIB、FⅧ合格率在14~≤16h开始显著变化(P0.05),FIB合格率16~≤18h开始显著变化(P0.05)。(3)与4℃ 6~≤8h组比较,22℃8~≤10h组新鲜冰冻血浆FIB、FⅧ的合格率与含量下降,差异有统计学意义(P0.05)。(3)速冻对FIB、FⅧ含量、合格率无影响(P0.05)。结论 4℃12h内或22℃ 8h内的新鲜冰冻血浆速冻后有更高的FIB、FⅧ合格率和含量,更适合用于制备冷沉淀。     

去冷沉淀血浆部分凝血因子及蛋白含量的研究

目的 探讨去冷沉淀血浆的临床应用价值,指导临床合理使用,并为国家行业标准的制订提供科学依据.方法 对来自同一袋血液新鲜冰冻血浆、普通冰冻血浆、去冷沉淀血浆三种标本,进行总蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、凝血因子V、Ⅷ、X含量检测,并进行统计分析.结果 去冷沉淀血浆与新鲜冰冻血浆和普通冰冻血浆相比,各项指标的差异都有统计学意义...     

血管性血友病因子vWF73和vWF114片段的表达及其在ADAMTS13活性测定中的应用

目的 构建血管性血友病因子(vWF)A2区片段vWF73和vWF114的表达质粒,在大肠杆菌中表达两种谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白,并探讨两种蛋白作为底物在测定ADAMTS13活性中的应用价值.方法 应用PCR的方法扩增vWF A2区内vWF73和vWF114的相应DNA片段,分别克隆至GST融合表达载体pGEX-6P-1进行诱导表达,Ni-NTA琼脂糖柱纯化可溶性蛋白部分.以Western blot法榆测正常人血浆、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者血浆和重组ADAMTS13(rADAMTS13)水解两种重组vWF A2区片段的情况,并以此为底物用抗GST和抗His两种抗体建立酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血浆ADAMqS13活性的新方法.结果 成功表达和纯化了ADAMTS13的两种可溶性小分子底物GST-vWF73-H和GST-vWF114-H,均能被rADAMTS13或正常人血浆有效地水解,而遗传性和特发性TTP患者血浆则无此作用.同时,以此为底物建立了测定ADAMTS13活性的ELISA方法.结论 采用原核表达系统成功得到了vWF A2区片段vWF73和vWF114两种GST融合蛋白,可作为底物用于ADAMTS13活性的测定.

Abstract：

Objective To construct the expression vectors of vWF73 and vWF114 fragments of von Willebrand factor (vWF) A2 domain, and to express glutathione S-transferase (GST) fusion proteins in E.coli, and to explore their values in measuring ADAMTS13 activity as substrates. Methods The DNA fragments encoding vWF73 and vWF114 were generated using PCR and separately cloned into pGEX-6P-1 , a Schistosoma japonicum GST fusion expression vector. The expression of GST-vWF73-H and GST-vWF114-H was induced in liquid culture, followed by purification with Ni-NTA agarose column. The cleavage of two GST fusion proteins by recombinant ADAMTS13 ( rADAMTS13) or plasma from normal individuals and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) patients were identified by Western blot. Based on an enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA) with anti-GST and anti-His monoclonal antibodies, GST-vWF73-H and GSTvWF114-H were used to measure plasma ADAMTS13 activity as substrates. Results Two small molecular substrates of ADAMTS13, GST-vWF73-H and GST-vWF114-H, are expressed and purified,which could be specifically cleaved by rADAMTS13 or plasma from healthy individuals, but not by plasma from congenital or idiopathic TTP patients. An ELISA assay was established to detect plasma ADAMTS13 activity using GSTvWF73-H and GST-vWF114-H as substrates. Conclusions Two GST fusion proteins in vWF A2 domain,vWF73 and vWF114, were expressed effectively using a prokaryotic expression system and could be used to detect ADAMTS13 activity as substrates.     

分离白膜后血浆制备冷沉淀的质量评价

目的对采用22℃手工制备富含血小板白膜后分离的血浆制备冷沉淀的质量进行评价。方法 2013年11月—2014年6月,共随机选取22℃手工制备富含血小板白膜后分离的血浆70例,将其作为原料血浆制成冷沉淀后留样(即A组)。同时另随机选取4℃常规制备新鲜冰冻血浆90例,将其作为原料血浆制成冷沉淀后留样(即B组)。用全自动血凝分析仪检测冷沉淀中Ⅷ因子、纤维蛋白原含量,运用统计学方法对比分析2组有无统计学差异。结果 A组、B组Ⅷ因子含量分别为(136.96±59.32)IU、(163.53±77.33)IU(P0.05),合格率分别为97%、99%(P0.05)。A组、B组纤维蛋白原含量为(165.68±25.73)mg/袋、(164.11±17.54)mg/袋(P0.05),合格率分别为91%和98%(P0.05)。结论本文试验数据显示,22℃手工制备富含血小板白膜后分离的血浆可以用于制备冷沉淀。     

去冷沉淀血浆和普通冰冻血浆的质量对比分析

目的对去冷沉淀血浆和普通冰冻血浆的部分质量指标进行比对分析,为明确质量标准和提高临床疗效提供依据。方法抽取本站2010年6月采集的经检测合格的全血（CPDA保养液）25袋,严格按照国家标准制备新鲜冰冻血浆、普通冰冻血浆（从新鲜液体血浆中留取部分血浆制备）、去冷沉淀血浆,分别留取相应的血浆标本各25份。于血液采集后第10天检测留取标本的总蛋白、纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ的含量以及测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）,根据检测结果进行对比分析。结果去冷沉淀血浆上述各项质量指标检测结果均明显低于普通冰冻血浆（P〈0.001）。结论去冷沉淀血浆和普通冰冻血浆在临床上不能等同标识和使用。     

滤白FFP与滤白CRP中部分凝血因子活性及蛋白含量的研究

目的分析滤白新鲜冰冻血浆(FFP)与滤白去冷沉淀血浆(CRP)中部分凝血因子活性及纤维蛋白原(Fib)与总蛋白(Tp)的含量,为我国制定滤白FFP及CRP中相应成分含量标准提供支持数据。方法按照标准操作规程制备滤白FFP及滤白CRP,随机留取40例滤白冷沉淀制备前后的血浆样本,采用全自动血凝分析仪及全自动酶标仪分别测定FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ活性及Fib、Tp含量水平。结果滤白FFP与CRP中FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ活性(%)及Fib、Tp含量(g/L)分别为:(79.89±16.9,63.37±17.54)、(120.98±45.51,81.22±23.78)、(86.65±22.69,23.52±4.87)、(77.53±12.39,67.59±12.23)及(2.25±0.56,1.58±0.28)、(67.94±8.39,47.43±6.19),两组观察指标统计分析P0.01。结论滤白CRP中的FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ活性及Fib、Tp含量较同源滤白FFP中相应成低。滤白CRP不具备滤白FFP的临床应用价值,为我国制定滤白CRP临床应用指南提供了实验数据。     

冷沉淀制备过程的质量控制和去冷沉淀血浆的临床应用价值探讨

目的通过控制冷沉淀的制备过程,分析去冷沉淀血浆的质量,为临床应用提供依据。方法采用离心法制备冷沉淀,检测同一献血者来源的新鲜冰冻血浆、去冷沉淀血浆、普通血浆标本中凝血因子FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ水平,以及纤维蛋白原和总蛋白水平并进行比较分析,同时检测冷沉淀中FⅧ与纤维蛋白原水平。结果去冷沉淀血浆的纤维蛋白原、总蛋白及FⅧ水平均低于新鲜冰冻血浆与普通冰冻血浆,且其FⅨ水平同样低于新鲜冰冻血浆,组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论去冷沉淀血浆在临床上不能等同于新鲜冰冻血浆和普通冰冻血浆使用,应通过对冷沉淀制备过程的有效控制,根据实际情况进行选择。     

特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮患者血浆中血管性血友病因子裂解蛋白酶的测定

血管性血友病因子（vwF）裂解蛋白酶（ADAMTS13）是近年发现的调节vwF分子量大小的主要蛋白酶。ADAMTS13活性缺乏临床上可导致血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发生。Moore等报道特发性血小板减少性紫癜（ITP）、系统性红斑狼疮（SLE）等患者ADAMTS13活性也降低，为进一步明确ADAMTS13在ITP和SLE发病中的意义，我们用新近建立的试剂盒检测了上述患者ADAMTS13及vWF的抗原含量。     

血管性血友病因子裂解蛋白酶的研究进展

血管性血友病因子裂解蛋白酶是一种大分子量的单链糖蛋白,属于金属蛋白酶的ADAMTS亚家族(ADAMTS13),在体外、体内有较长的半生存时间.其活性主要是在vWF225kDa亚单位A2区域的Tyr842-Met843间裂解vWF,将UL-vWF转变为分子量相对小的多聚体形式,从而保证vWF多聚体的多态性分布,预防微血管内血小板血栓形成.     

两种方法融化冰冻血浆制备冷沉淀的比较

<正> 通常采用4℃冰箱融化冰冻血浆制备冷沉淀(每单位由400ml全血制备),融化时间长,约需16～20小时.为了缩短制备冷沉淀融化血浆的时间,我们试用4℃冰水和4℃冰箱两种方法融化血浆并对因子Ⅶ活性单位得率进行比较.现将结果报告如下:     

以新单克隆抗体为基础的酶免疫测定法检测血浆ADAMTS 13活性浓度

背景ADAMTS13能特异性裂解大的血管假性血友病因子（VWF）多聚体，后者在高切应力下能诱发血小板性血栓形成。伴有血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的病人ADAMTS 13活性低下。测定血浆中ADAMTS 13活性浓度是鉴别诊断血栓形成性微血管病的前提。本文介绍一种独特的高灵敏度的测定ADAMTS 13活性的酶免疫分析法（EIA）。研究设计与方法ADAMTS 13水解VWF中Y1605和M1606之间的肽键。     

血栓性血小板减少性紫癜14例临床分析

为了提高对血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的认识,对14例TTP患者的临床表现、实验室特点、治疗和转归等资料进行了回顾性分析。结果表明：在14例,TTP患者中,7例有诱发因素（妊娠4例和感染3例;1例为系统性红斑狼疮,1例为造血干细胞移植后患者）。14例患者在起病时或病程中均有不同程度的神经精神症状、Coombs试验阴性的溶血性贫血和血小板减低;8例患者有不同程度的不规则发热,以中等度发热为主;8例患者有肾脏损害,均出现蛋白尿,其中4例合并肾功能异常;在14例患者中13例血浆血管性血友病因子裂解酶（ADAMTSl3）活性明显减低（均低于10％）,其中12例患者同时存在ADAMTS13抑制物。经过血浆置换、肾上腺糖皮质激素和利妥昔单克隆抗体等治疗后,12例患者完全缓解,但8例2年复发,2例死亡。结论：TTP是由于血小板性微血栓形成而造成全身多系统、多脏器功能障碍的一种血栓性微血管病,临床过程凶险,死亡率极高,早期诊断和以血浆置换为主要手段的早期治疗可大大改善患者的预后。     

血栓性血小板减少性紫癜16例临床分析

目的分析16例血栓性血小板减少性紫癜（TTP）患者的临床资料,以提高临床的早期诊断率。方法收集2007年～2011年苏州大学附属第一医院临床诊断为TTP的住院患者资料共16例,分析其临床资料,包括首发症状、病程、临床特点、实验室检查、治疗及转归。结果16例患者均有溶血性贫血、血小板减少、神经系统损害表现,15例有发热,8例有肾功能不全。12例ADAMTS13活性明显降低,其中8例ADAMTS13抑制物阳性。15例患者进行了血浆置换,12例患者治愈或好转,有效率为80％。结论ADAMTS13活性及抑制物检测有利于TTP早期诊断,尽早开始血浆置换可改善预后。