中药复方君子汤联合阿霉素逆转白血病K562/VCR细胞多药耐药及诱导凋亡的机制研究

【目的】探讨中药复方君子汤(FFJZ)联合阿霉素(DOX)逆转白血病K562/VCR细胞多药耐药及诱导凋亡的机制。【方法】采用CCK8法检测细胞耐药性及耐药性逆转作用;采用流式细胞术检测细胞总凋亡率和早期凋亡率;采用实时荧光定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因1(MDR1)、P糖蛋白(P-gp)、乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的基因表达水平;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达。【结果】CCK-8检测结果显示:无细胞毒性的FFJZ(6 mg/m L)、DOX(5 mg/m L)单独用药可显著降低K562/VCR的半数抑制浓度指数(IC_(50))(P0.05),两药联合应用对K562/VCR逆转指数显著高于单独应用(P0.05)。流式细胞术结果显示:作用浓度为4、6 mg/m L的FFJZ联合DOX(5 mg/m L)能够提高K562/VCR细胞总凋亡率和早期凋亡率,与DOX对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果显示:FFJZ联合DOX应用可下调MDR1、BCRP、P-gp m RNA表达,与DOX对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);FFJZ联合DOX应用可上调Bax m RNA、下调Bcl-2 m RNA表达,与DOX对照组比较,差异有统计学意义(P0.01)。Western blot结果显示:FFJZ联合DOX与对照组比较,Bax蛋白表达显著上调(P0.05),Bcl-2蛋白表达显著下调(P0.05),与Bax、Bcl-2 m RNA表达一致。【结论】无细胞毒性的FFJZ、DOX对K562/VCR细胞耐药性均有逆转作用,两药联合应用具有明显的协同效应,其机制可能与其上调促凋亡基因Bax和下调抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。     

人参皂苷 Rh2抗白血病多药耐药细胞 K562/VCR作用研究

目的 通过观察人参皂苷 Rh2对人白血病多药耐药 (MDR) 细胞 K562/VCR 生长、凋亡的作用和逆转耐药的情况,探索该药在抗人白血病 MDR 方面的应用价值。方法 将人参皂苷Rh2与 K562、K562/VCR 细胞共培养 48 h 后采用 MTT法分析其对细胞生长的抑制率;将其与 K562/VCR 细胞于 37 ℃ 孵育 30 min 后,采用 Annexin V 和 PI 双染法在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况;并观察其对 K562/VCR 细胞摄取柔红霉素 (DNR) 能力及细胞表面 P-糖蛋白 (P-gp) 表达的影响;在 DNR 与 K562/VCR 培养体系中加入不同质量浓度人参皂苷Rh2,孵育 48 h 后观察人参皂苷Rh2对 K562/VCR细胞耐药的逆转情况。结果 人参皂苷Rh2 可明显抑制 K562 和 K562/VCR 细胞的生长,并呈量效关系,人参皂苷Rh2对 K562 和 K562/VCR 的半数抑制浓度 (IC50) 分别为44.5、59.4 μg/mL。K562/VCR 经人参皂苷Rh2 在 37 ℃ 作用 30 min 后,细胞的凋亡明显增加,随人参皂苷Rh2质量浓度的增加,凋亡细胞的比例明显增加［人参皂苷 Rh2 300 μg/mL,Annexin V+ 细胞 (51.5±6.9)%］。K562 细胞经长春新碱 (VCR) 诱导耐药后,P-gp 表达率明显提高 (从 4.28% 到 93.80%),DNR 摄取率减少,25 μg/mL 以上质量浓度的人参皂苷Rh2即可明显提高 K562/VCR 对 DNR 的摄取,但 P-gp 的表达无明显改变。同时,它可明显提高 DNR 对 K562/VCR 的杀伤率,50 μg/mL 人参皂苷 Rh2 可使 K562/VCR 对 DNR 的敏感性提高到原来的 6.30 倍。 结论 人参皂苷 Rh2 能抑制 K562/VCR 细胞生长,诱导其凋亡,还可以逆转 K562/VCR 的耐药,是一种具有广阔开发前景的抗白血病药物。     

异博定对白血病K562细胞耐药性的逆转作用

目的：研究异博定对Ｐ－糖蛋白（Ｐｇｐ）介导的人类白血病Ｋ５６２细胞多药药作用。方法：用台盼蓝拒染法检测药物敏感性及异博定对细胞耐药性的影响,用免疫组织化学法检测Ｐｇｐ的表达,用汉式细胞仪检测细胞柔红霉素（ＤＮＲ）积聚。结果：ＤＮＲ诱导的耐药细胞Ｋ５６２／Ｄ对ＤＮＲ,长春新碱（ＶＣＲ）、高三尖杉脂碱（ＨＨＴ）、鬼臼药物积聚增加,明显地逆转了Ｋ５６２／Ｄ细胞对ＤＮＲ、ＶＣＲ、ＭＩＴ、ＨＨＨＴ、ＶＰ－１     

苦参碱逆转人白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究

[目的] 探讨苦参碱对人白血病K562／ADM细胞对阿霉素耐药性的逆转作用。[方法] MTT法测定苦参碱的细胞毒性及其对K562／ADM细胞药敏性的影响,荧光分光光度法检测细胞内药物浓度的改变,流式细胞术检测耐药细胞凋亡百分率的变化。[结果] 苦参碱的非细胞毒性剂量为50μg／mL,低细胞毒性剂量为125μg／mL。50μg／mL苦参碱可增加K562／ADM细胞内阿霉素(ADM)浓度和K562／ADM细胞凋亡百分率,使K562／ADM细胞的IC50由原来的35．2μg／mL降低至15．8μg／mL,其逆转倍数为2．2倍。[结论] 苦参碱可部分逆转人白血病K562／ADM细胞对阿霉素的耐药性,其逆转机制与增加细胞内药物积累有关。     

凋亡调节蛋白的表达与K562／VCR多药耐药性的关系

目的探讨K562/VCR细胞中凋亡调节蛋白表达的变化与其多药耐药性(MDR)的关系。方法通过免疫细胞化学法和免疫印迹法(westernblot)对凋亡调节蛋白Bcl-2、Bcl-X     

川芎嗪对转基因多药耐药细胞K562/MDR耐药性的逆转作用

目的：研究川芎嗪（TMP）与环孢菌素A（CsA）单独及联合逆转人红白血病多药耐药细胞K562/MDR的多药耐药性（MDR）,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以倍比稀释后不同浓度的TMP（50～6　400 mg?L^-1 ）和CsA（0.5～256 mg·L^-1 ）作用于体外培养的K562/MDR细胞72 h,采用MTT法检测细胞生长率,确定TMP和CsA的非细胞毒性剂量;采用非细胞毒性剂量,实验分为5组：G1组（TMP+ADM+K562/MDR）、G2组（CsA+ADM+K562/MDR）、G3组（TMP+CsA+ADM+K562/MDR）、阴性对照组（以K562/S代替K562/MDR）、空白对照组（以1640培养基代替药物）,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC₅₀,计算耐药倍数和逆转倍数;利用荧光分光光度法检测各组细胞内ADM浓度;流式细胞术检测跨膜糖蛋白P-gp的表达情况。结果：TMP及CsA的非细胞毒性剂量分别为320和2.0 mg·L^-1,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA均能降低K562/MDR细胞的耐药性,逆转倍数分别为5.2及9.6倍,并且两者联合应用,逆转倍数为15.6倍;TMP和CsA单独及联合应用均能明显增加K562/MDR细胞内ADM浓度;TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,并且两者联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显降低,与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01)。结论：TMP和CsA单独及联合应用可逆转K562/MDR细胞对化疗药物ADM的MDR,且两者具有协同作用。其逆转机制可能为降低P-gp水平,升高细胞内ADM浓度,增强对ADM的敏感性,从而发挥治疗肿瘤的作用。     

微波联合化疗对白血病耐药细胞株K562/MDR的作用

目的 :研究微波联合化疗药物对白血病耐药细胞株K5 6 2 MDR的抑制作用。方法 :用四唑蓝快速比色法 (MTT法 )检测细胞存活率。结果 :吡柔比星 (THP)经 2 0min 43℃水浴加热处理 ,对K5 6 2 MDR的抑制作用明显提高 (P <0 .0 5 ) ,再联合微波对吡柔比星抑制作用的提高不明显。长春新碱 (VCR)经 2 0min 43℃水浴加热处理 ,对K5 6 2 MDR的抑制作用提高不明显 ,但联合微波后 ,长春新碱的抑制作用明显提高 (P <0 .0 5 )。结论 :微波与高温能增加K5 6 2 MDR细胞对化疗药物的敏感性。     

DC-CIK细胞对K562/ADR细胞多药耐药的逆转作用

目的 探讨共培养树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK),即DC-CIK逆转白血病细胞多药耐药的作用及相关机制.方法 采用RT-PCR方法检测DC-CIK处理后的耐药细胞株(K562/ADR细胞)中多药耐药基因(mdr1基因)的表达;利用MTT法检测DC-CIK细胞处理后的耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化.结果 经DC-CIK作用后的K562/ADR细胞mdr1表达明显低于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞组(P<0.05),而且其对阿霉素的敏感性也明显高于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞(P<0.05).结论 DC-CIK可逆转耐药细胞的多药耐药,其作用机制可能与下调耐药细胞中mdr1的表达有关.     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外逆转K562/ADR细胞株多药耐药性观察

目的：研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）体外逆转K562／ADR细胞株多药耐药（MDR）的可行性。方法：在含细胞因子（人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人重组白细胞介素-1、人重组白细胞介素-4和人重组肿瘤坏死因子-α）的RPMI1640完全培养液中诱导K562细胞株、K562／ADR耐药细胞株分化成树突状细胞（DC）。正常人外周血单个核细胞（PBMC）在上述细胞因子诱导下培养成CIK，与成熟的DC共培养成CIK＋K562／ADR-DC。应用流式细胞术检测CIK及CIK＋K562／ADR—DC的细胞表型。MTT法测定CIK和K562／ADR-DC对K562／ADR的细胞毒作用，流式细胞仪检测CIK组和CIK＋K562／ADR-DC组细胞中糖蛋白（P-gP）、阿霉素（ADR）的含量，RT-PCR检测mdr-1基因表达。结果：C1K、C1K＋K562／ADR-DC细胞经流式细胞仪检测，均具有自己独特的表型。PBMC诱导培养4d后，CIK开始增殖，第7—9天细胞数量明显增多。K562／ADR来源的DC和CIK共培养后，细胞增殖速度明显加快，9d以后与C1K相比2组细胞的增殖速度呈现明显差异。CIK＋K562／ADR．DC细胞对K562／ADR的细胞毒作用在效靶比20：1范围内明显高于CIK细胞（P〈0．05）。CIK组和CIK＋K562／ADR-DC组细胞的P-gP和Mdr-1与对照组相比显著降低（P〈0．05），ADR表达明显升高。结论：CIK＋K562／ADR．DC对高表达P-gP的K562／ADR耐药细胞株表现出了特异性细胞毒作用，有效提高了细胞内ADR的含量，下调了P-gP蛋白和mdr-1基因的表达。从而使免疫效应细胞体外逆转MDR的效果得以显现。     

普乐林对K562、K562/AO2的增殖抑制和耐药逆转作用

目的 研究黄酮类化合物普乐林(Puerarin)对K562和K562/AO2细胞增殖抑制、药物增敏、耐药逆转的作用.方法 台盼蓝拒染试验、MTT实验检测Puerarin对K562、K562/AO2的抑制作用;MTT实验检测阿霉素单独和与Puerarin合用对K562、K562/AO2的半数抑制浓度.结果 3.2μmol/L的Puerarin即对K562、K562/AO2有生长抑制作用,其最大抑制浓度为25.0μmol/L,Puerarin对两种细胞的抑制差异无统计学意义(P＞0.05);阿霉素对K562细胞的IC50为0.131μg/mL,对K562/AO2的IC50为7.542μg/mL,耐药倍数为57.14倍;Puerarin加大了阿霉素对K562的杀伤敏感性(最大增敏倍数1.42),同时能部分逆转K562/AO2对阿霉素的耐药性(最大相对逆转效率91%).结论 Puerarin对K562、K562/AO2细胞的增殖抑制作用有限;但Puerarin具有较明显逆转K562/AO2对阿霉素的耐药作用.     

亚砷酸对白血病K562/A02细胞的作用及机制

目的研究亚砷酸对白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞的作用及对多药耐药基因1（mdr1）、P糖蛋白（P-gp）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨亚砷酸逆转白血病多药耐药（MDR）的作用机制。方法将K562/A02细胞与不同浓度的亚砷酸（0、0.5、2.0、5.0μmol/L）共同孵育,分别在24、48、72h时,用Wrights染色法观察K562/A02细胞形态,流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR法检测mdr1mRNA的表达,免疫组织化学法观察P-gp表达,并用ELISA法检测VEGF的浓度。结果随着亚砷酸作用浓度和时间的增加,K562/A02细胞的数目减少,并出现凋亡形态学改变,FCM显示随着作用浓度和时间的增加,细胞凋亡率逐渐上升;从作用48h组开始,mdr1mRNA及P-gp的表达出现显著降低（P〈0.05）,mdr1mRNA条带颜色较空白对照组明显变浅,mdrl/GAPDH灰度比值下降,此时,P-gp的灰度值上升,且随亚砷酸作用浓度和时间的增加,mdr1mRNA条带颜色进一步变浅,表达水平进一步下降;ELISA法检测表明从0.5μmol/L作用24h组开始,VEGF浓度即下降至405.02pg/mL（P〈0.05）,相同作用时间下以5.0μmol/L组较其它浓度组下调VEGF的作用最为显著。结论亚砷酸呈药物浓度-时间依赖性抑制K562/A02细胞增殖,诱导其凋亡,下调VEGF表达,有效抑制了mdrlmRNA的产生和P-gp的合成。     

阿霉素纳米粒对白血病耐药细胞株K562/DOX耐药逆转作用的研究

目的　合成阿霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒 ,观察其对阿霉素耐受性细胞株K5 6 2 (K5 6 2 /DOX)耐药性逆转效果并探讨可能机制。方法　采用乳液聚合法合成纳米粒 ,透射电镜观察计算粒径 ,分光光度法计算包封率 ;以梯度浓度的阿霉素纳米粒处理培养的K5 6 2 /DOX细胞 ,噻唑蓝比色法 (MTT)检测K5 6 2 /DOX细胞的半数生长抑制浓度 (IC50 )并计算逆转倍数 ;流式细胞术检测细胞内药物浓度 ;TUNEL法检测药物诱导后凋亡的发生及凋亡率。结果　阿霉素纳米粒平均粒径 (98 5± 3 7)nm ,包封率为 95 % ;MTT结果显示阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX细胞的生长抑制率较单纯阿霉素显著增高 ,阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX的耐药逆转倍数为 6 2 ;TUNEL检测经 10 μg/ml阿霉素纳米粒处理后的K5 6 2 /DOX平均凋亡率为 38 7%。结论　以聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒为载体的阿霉素可增强诱导K5 6 2 /DOX细胞凋亡的效率和有效逆转其耐药性。     

Thapsigargin逆转K562/A02细胞多药耐药性的实验研究

目的 探讨内质网Ca^2 -ATP酶抑制剂thapsigargin对白血病多药耐药细胞株K562／A02化疗敏感性的影响。方法 用MTT比色法检测K562／A02细胞耐药性、thapsigargin的增殖抑制活性及其对K562／A02细胞化疗敏感性的影响；丫啶橙(AO)／溴化乙锭(EB)染色荧光显微镜观察thapsigargin处理后K562／A02细胞形态改变；流式细胞仪(FCM)检测P-糖蛋白(P-gp)表达；荧光显微镜检测Pgp功能。结果 ①thapsigargin对K562和K562／A02细胞的增殖抑制活性呈剂量和时间依赖性，K562／A02细胞较K562细胞对thapsigargin更敏感，thapsigargin诱导K562／A02细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变。②K562／A02细胞对阿霉素(ADM)、柔红霉素(DNR)、长春新碱(VCR)、依托泊苷(VP-16)、高三尖杉酯碱(HHT)和米托蒽醌(MXT)均出现不同程度的耐药性；thapsigargin抑制K562／A02细胞P-gP功能而对其表达无影响，thapsigargin能增加K562／A02细胞对ADM、DNR、VCR、VP-16、HHT和MXT的化疗敏感性。结论 Thapsigargin能诱导白血病多药耐药细胞株K562／A02细胞凋亡并能部分逆转K562／A02的多药耐药性；thapsigargin的多药耐药逆转功能可能与其凋亡诱导作用和抑制PgP功能有关。     

参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响

目的研究参芪扶正注射液对K562耐药细胞株（K562／ADM）多药耐药的影响。方法采用MTT法检测参芪扶正注射液的细胞毒性；采用PI单染色流式细胞术检测ADM加以及不加参芪扶正注射液处理K562／ADM后的细胞凋亡率；采用直接免疫荧光法流式细胞术检测参芪扶正注射液处理K562／ADM细胞的Bcl-2基因表达水平。结果（1）参芪扶正注射液在10μL／mL时对K562／ADM增殖无抑制作用；（2）参芪扶正注射液明显增加ADM对K562／ADM的毒性作用（P〈0.05），参芪扶正注射液在10μL／mL时耐药逆转倍数为1．71；（3）参芪扶正注射液可明显增强ADM对K562／ADM的促凋亡作用（P〈0．05）；（4）参芪扶正注射液可明显抑制K562／ADM的Bcl-2基因表达（P〈0.05）。结论参苠扶正注射液可以逆转K562／ADM耐药性，其可能机制是促进细胞凋亡和下调Bcl-2表达。     

Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in K562/VCR vincristine-resistant leukemia cell line

ObjectiveTo probe insights into the reversal effect of bufalin on vincristine-acquired multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562/VCR.MethodsProliferative inhibition rate and the reversal index (RI) of bufalin were determined by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The uptake of Adriamycin (ADM) in K562/VCR cells, cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM). Cell morphologic changes were observed with Wright-Giemsa staining. The expression of P-glycoprotein (P-gp), multidrug-associated protein-1 (MRP1), Bcl-xL and Bax protein were measured by immunocytochemistry.ResultsThe human leukemia multidrug resistant K562/VCR cells showed no cross-resistance to bufalin. The RIs of bufalin at concentrations of 0.0002, 0.001 and 0.005 μmol/L were 4.85, 6.94 and 14.77, respectively. Preincubation of 0.001 μmol/L bufalin for 2 h could increase intracellular ADM fluorescence intensity to 28.07% (P<0.05) and down-regulate MRP1 expression simultaneously, but no remarkable effect was found on P-gp protein. Cell cycle analysis indicated increased apoptosis rate and apparent decreased G2/M phase proportion after treatment with bufalin. When exposed to 0.01 μmol/L bufalin, typical morphological changes of apoptosis could be observed. Down-regulation of Bcl-xL and up-regulation of Bax expression in K562/VCR cells could be detected by immunocytochemistry.ConclusionBufalin could partly reverse the MDR of K562/VCR cells, with a possible mechanism of down-regulating MRP1 expression and activating apoptosis pathway by altering Bcl-xL/Bax ratio.     

粉防己甲素逆转耐药细胞株K_(562)/VCR多药耐药的研究

粉防己甲素(Tet)可逆转耐药细胞株K_(562)/VCR对长春新碱(VCR)、足叶乙甙(VP—16)、阿霉素(Dox)和柔红霉素(Dau)的多药耐药。2×10~(-7)～5×10~(-6)μmol/L处理细胞后,VCR、VP—16、Dox和Dau对K_(562)/VCR的半数抑制剂量(IC_(50))分别减少3.4～45.5、1.5～38.5、2.6～9.7和3.2～33.1倍。1×10~(-6)μmol/L Tet与0.02～0.2μmol/L的上述抗癌药共同处理细胞后,其细胞集落数分别减少44.3～84.5、56.4～79.0,52.6～97.4和63.9～10.0％。本文结果表明,Tet是一有效的肿瘤多药耐药逆转剂。     

洛美利嗪逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的 :研究洛美利嗪对肿瘤多药耐药的逆转作用 ,探讨洛美利嗪逆转肿瘤细胞多药耐药的机制。方法 :以人红白血病细胞系K5 6 2及其耐药细胞系K5 6 2 /A0 2 (耐阿霉素 )为研究对象 ,采用MTT法检测细胞毒作用 ;免疫组化测定法检测P 糖蛋白 (P glycoprotein ,P gp)表达水平 ;RT PCR法检测mdr1mRNA水平 ;以流式细胞术测定两种细胞系内罗丹明 12 3(Rh12 3)的潴留来反映P gp的外排功能。结果 :与K5 6 2细胞系相比 ,K5 6 2 /A0 2耐药细胞系mdr1mRNA及P gp高表达 ,Rh12 3潴留减少。洛美利嗪 (10 μmol/L)对K5 6 2 /A0 2细胞的mdr1mRNA及P gp表达水平无明显影响 (P >0 .0 5 )。洛美利嗪对K5 6 2 /A0 2细胞的阿霉素 (ADM)、长春新碱 (VCR)细胞毒性有剂量相关性增敏作用。洛美利嗪能增加K5 6 2 /A0 2耐药细胞系的Rh12 3潴留。结论 :洛美利嗪对K5 6 2 /A0 2细胞的ADM、VCR细胞毒性有剂量相关性增敏作用 ,其机制可能与增加细胞内药物浓度有关。     

苦参碱逆转人胃癌细胞株SGC7901/VCR耐药性实验研究

目的 研究苦参碱(Matrine)对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药的逆转效应及其机制.方法 以长春新碱(VCR)诱导的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR为研究对象,MTT法研究苦参碱对体外培养的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR细胞增殖的影响及逆转效应、用间接免疫荧光法经流式细胞仪检测MRP的表达并分析其机制.结果 MTT法显示苦参碱在0.5、1.0、2.0 mg·mL-1浓度下处理SGC7901/VCR细胞72 h后,其生长抑制率依次为10%、15%、32%,且可以逆转SGC7901/VCR对VCR的耐药,呈剂量依赖性,逆转倍数分别为9.4、13.4、24.5倍.0.5 mg·mL-1苦参碱与SGC7901/VCR细胞共同培养24 h后,SGC7901/VCR细胞的MRP表达从(36.00±4.32)%降低至(25.00±3.85)%(P<0.01).结论 苦参碱可以体外逆转人胃癌细胞多药耐药细胞SGC7901/VCR的耐药性,其逆转机制与降低MRP的表达有关.