转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞*

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA 和蛋白进行检测。结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d 的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA 和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景:内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化.目的:观察将转化生长因子β3 通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力.方法:取体外培养的第3 代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d 细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3 的体外表达.RT-PCR,免疫印迹western blot 分别从基因和蛋白水平上检测1,2 周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2 周蛋白多糖的表达.结果与结论:重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化.证实转化生长因子β3 可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化.     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的:构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法:通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论:酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor, hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞.方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成.根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达.结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达.结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择.     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹westernblot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

外源Smad7转染肝星状细胞及对转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

背景:Smad7是转化生长因子β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用.目的:构建并鉴定大鼠Srnad7真核表达质粒,观察外源Smad7可否有效转染肝星状细胞T6,并进一步研究其对转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响.设计、地点:基因重组及细胞观察实验,于新疆石河子大学医学院第一附属医院完成.材料:pcDNA3.1(+)质粒为课题组保留;大肠杆菌DH5a系石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室所赠;肝星状细胞T6细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供品.方法:采用基因重组技术将Smad7cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染肝星状细胞T6细胞,分为正常对照、空质粒及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应法检测各组中Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照组、空质粒组比较:Smad7 mRNA 达显著增加(P<0.01);转化生长因子β、Ⅰ型胶原mRNA表达减少(P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05).正常对照组、空质粒组smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P值均>0.05).结论:大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,外源Srnad7转染肝星状细胞T6细胞后可有效表达,并能降低转化生长因子β及Ⅰ型胶原mRNA表达水平.     

转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：针对转化生长因子-β（TGF-β）Ⅱ型受体基因的不同部位，构建不同TG-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA（shRNA）表达质粒载体，在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法：用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencer^TM 3．1-H1 neo vector中，构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-β R ⅡshRNA1、2、3、4。脂质体介导转染成人原代成纤维细胞，经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。结果：3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westem blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencer^TM3．1-H1—TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。结论：成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilenceir^M3.1—H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3，并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

建立pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒和脂质体介导转染原代培养新生猪AEC-Ⅱ方法

目的 构建pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒,利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)中,为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础.方法 应用含人TGF-β1 CDS的质粒,设计PCR引物扩增出其CDS片段,将其与空质粒pEGFP-N1用XhoI和EcoRI双酶切,T4 DNA Ligase连接双酶切产物,将连接产物转化入DH5α中,培养16 h后抽提质粒,PCR法鉴定和测序证实TGF-β1 CDS序列正确.采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染,将新生猪AEC-Ⅱ原代培养48 h至细胞融合80％ ～ 90％,换为无血清培养液;将质粒DNA(pEGFP-N1-TGF-β1重组质粒)和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀,置于培养箱中培养4～6h,更换为完全培养液;转染24～48 h后,荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平.结果 PCR法及测序鉴定证实TGF-β1 CDS序列正确,重组质粒构建成功,采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195.5 μg/mL,转染后48 h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达,证实已将其成功转染入原代培养的AEC-Ⅱ中.结论 成功构建了pEGFP-N1-TGF-β1真核表达载体,并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC-Ⅱ中,为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础.     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。目的：利用多形上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，MUC1）多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte macrophagehage colony stimulating factor，GM-CSF）基因重组的真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）．MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005—09，2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料：真核表达载体pcDNA3．1（＋）由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf（-）-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E．coli DH5α为自备，雌性BALB／c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶叨鉴定及序列分析后，与GM—CSF基因克隆入pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）-MUC1-GM—CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明，重绍质粒含育人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM—CSF抗体。结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM—CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。