大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定及神经样细胞分化

目的建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养、纯化、扩增的实验体系,并进行细胞表面抗原的鉴定及定向诱导分化检测。方法采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化大鼠BMSCs;观察细胞形态,采用细胞免疫化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达;分别使用β-巯基乙醇及碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经样细胞分化,采用Western印迹法检测诱导后神经标志蛋白[神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]表达。结果培养至第3代的BMSCs,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;经诱导后,神经标志蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可分离、培养得到高纯度、具备相关生物学特性的BMSCs,且经诱导可定向分化为神经样细胞。     

鼠成骨细胞诱导兔BMSCs成骨的实验观察

目的观察乳鼠成骨细胞诱导乳兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨情况。方法取SD大鼠乳鼠颅盖骨,采用组织块培养法培养成骨细胞;取乳兔长骨,采用全骨髓培养法培养BMSCs;用Transwell双层细胞培养板共育,实验组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室不接种细胞,两组培养下室均接种BMSCs。观察BMSCs形态变化,用酶标仪检测诱导分化后BMSCs的ALP活性,RT—PCR检测BMSCs中的骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Ⅰ型胶原基因。结果共培养后实验组BMSCs形态逐渐向成骨样细胞转化,对照组无明显变化;实验组BMSCs中ALP活性高于对照组,实验组的BMSCs的骨钙素、BMP-2、Ⅰ型胶原基因有所表达,对照组无表达。结论乳鼠成骨能够诱导乳兔BMSCs向成骨细胞分化。     

罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立鸡骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和鉴定体系。方法从1～14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞,差速贴壁法纯化、扩增BMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态特征,MTY法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞标志物,并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形,生长状态良好;CD29阳性表达率为92．10％,CD34阳性表达率仅为0．80％;经成骨诱导分化,出现明显的钙化结节,茜素红染色阳性;经成脂诱导分化,油红O染色阳性,细胞内出现明显的脂质小滴。结论建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系,为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础。     

胎肝来源间充质干细胞的分离、培养与多向分化

目的从胎肝中分离培养间充质下细胞，并研究其牛物学特性。方法用优化的方法从胎肝中分离获得间充质干细胞。利用流式细胞仪分析细胞表型和细胞周期分布，并体外诱导成骨、成脂肪和成肝组织细胞分化。并用染色方法鉴定成骨、成脂肪分化结合形态学方法和RT-PCR方法鉴定成肝组织分化结果。结果从胎肝中分离培养的细胞为成纤维样，贴壁生长．表型相对均一，表面标志为CD90，CD44，CD147，而CD34，CD45，HLA-DR，具有向肝组织分化的潜能，并可向成骨和成脂肪分化。结论从胎肝中可分离培养得到具有多向分化潜能的间充质干细胞。     

一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、改良培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法通过改良全骨髓贴壁法对4周龄SD雄性大鼠脱颈处死,无菌条件下分离出骨髓进行原代培养、消化传代培养及纯化。对BMSCs进行形态学观察,收获第四代BMSCs进行流式细胞仪检测其细胞表面标记物CD90、CD29、CD34、CD45的表达率及向成脂方向诱导分化。结果 BMSCs的原代培养形态学观察可见骨髓细胞接种于培养皿后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁,呈圆形、梭形或多角形。通过换液去除未贴壁的杂质细胞,可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长,四五天可见放射状排列的细胞集落,伸出长短不一、粗细不均的突起,梭形细胞为主,胞浆丰富,胞核大、核仁清晰。7~8 d细胞呈集落生长,融合80%~90%,呈漩涡状,同向排列,9~10 d细胞排列紧密,逐渐融合成片。传代培养可见消化传代后,传代细胞24 h完全贴壁生长。细胞形态均一,呈梭形生长,细胞生长旺盛。四至五天可传代1次。可稳定连续传代7代以上,细胞形态及生长速度未见明显变化。BMSCs表面标记物的表达通过流式细胞仪检测结果显示,培养的第4代大鼠BMSCs均一表达CD90,CD29,阳性率分别为96.9%,96.6%;而CD34,CD45,呈阴性,阳性率分别为0.395%,7.56%。BMSCs加入成脂诱导剂后18 d,诱导而成的脂肪细胞累积脂质,脂滴变大,合并呈串珠状,经油红O染色呈鲜红色。结论与传统全骨髓贴壁法相比,改良后的全骨髓贴壁法操作步骤简单,降低离心对细胞的损害,减少了污染机会,节省经费,且分离的BMSCs细胞活性高,可大量分离、纯化、扩增,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。可为组织器官缺损性疾病、恶性肿瘤等的治疗和组织工程提供充足的种子细胞来源,具有重要的现实意义。     

骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定

目的 研究分离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进行诱导分化鉴定,为临床进行缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础.方法 用灌注法分离小鼠骨髓血管内皮祖细胞,用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化,形态学观察细胞的生长过程,并利用抗CD34抗体鉴定血管内皮祖细胞,利用抗vWF抗体、抗eNOS抗体鉴定血管内皮细胞. 结果小鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长,可诱导分化为表达特异性组织蛋白的内皮细胞.结论 在小鼠骨髓内可分离出骨髓源性血管内皮祖细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力.     

人脂肪间充质干细胞体外分离、培养的方法研究

目的：探讨人脂肪间充质干细胞体外分离及培养方法。方法用消化离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,以1×104/cm2接种于体积分数为0．1％胎牛血清的LG-DMEM培养基中,并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原,行成脂及成骨诱导检测其多向分化潜能。结果获取的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形的成纤维细胞样,细胞增殖良好;细胞生长曲线测定表明接种后第4天细胞进入指数增长期,第8天后生长进入平台期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测表明细胞高表达 CD13、CD73,低表达 CD34、CD45及 HLA-DR;能诱导成脂及成骨细胞。结论利用消化离心法在体外能分离得到脂肪间充质干细胞,细胞生长良好,可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞诱导分化的机制

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外向心肌细胞(CM)定向诱导分化的机制.方法 全骨髓贴壁法体外获取大鼠BMSC,流式细胞术检测CD44、CD45和CD105的表达率对其进行鉴定,以未加一抗只加二抗的BMSCs作为平行对照组.选用生长良好、纯度达到95％的P5代BMSCs,用5-氮杂胞苷(5-Aza)10 μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponineI的免疫组化检测.在诱导前及诱导2e以RT-PCR方法检测RhoA的表达变化.结果 体外分离纯化培养扩增出大鼠BMSCs,表达CD44、和CD105.经10 μmol/L 5-Aza诱导分化的BMSCs表达心肌特异性标记TroponineI;RT-PCR的结果显示,诱导后的BMSCs表达RhoA.结论 BMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10 μmol/L.5-Aza体外可能通过RhoA途径在BMSCs分化为心肌细胞过程中起着重要调控作用.     

逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观察逆转录病毒介导绿色荧光蛋白基因在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)中的表达,为干细胞移植机制的研究提供基础.方法:采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导其向成脂肪方向分化,行细胞表面抗原鉴定,及油红O染色评价细胞成脂肪情况.在此基础上,采用逆转录病毒pLEGFP-N1对细胞进行荧光蛋白标记,观察细胞形态学改变荧光表达的时间与强度,计算转染率.结果:细胞扩增迅速,形态良好,纯度较高,经诱导后细胞内可见脂滴.逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并对4 wk体外培养进行了良好的标记.结论:逆转录病毒pLEGFP-N1转染效率高,转染成功的BMSCs可以长期稳定表达目的基因,是一种理想的病毒载体.     

中药及其活性成分影响骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的研究进展

<正>成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(BMSCs),BMSCs的成骨与成脂分化存在相互制约的平衡关系,一旦该平衡被打破,便会引起代谢相关疾病或发育异常。近年来研究发现,中药在调控BMSCs成骨、成脂分化平衡方面具有一定的积极作用。本文将围绕中药影响BMSCs成骨、成脂分化及其机制进行简要综述。1概述在不同诱导条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞     

Differentiation of bone marrow stem cells into the cardiomyocyte-like cells induced by fetal cardiac supernatant with 6-bromoindirubin-3-oxime

Background Our previous study showed the 150 mg/mL fetal cardiac supernatant (FCS) could induce differentiation of BMSCs into cardiomyocye-like cells without cardiomyocyte touch,but differentiation efficiency is not high enough.Inhibition of glycogen synthase kinase-3 enhanced the proliferation and survives of stem cells.We tested if 6-bromoindirubin-3-oxime (BIO,glycogen synthase kinase-3 inhibitor) enhances the effects of FCS on differentiation of BMSCs and explore the growth factors in FCS.Methods BMSCs were isolated from the femur and tibia of four-week-old male Sprague-Dawley rats and co-cultured with FCS (150 mg/mL) that was made from fetal hearts from nineteen-day pregnant Wistar rats.BIO with different concentration (0,1,10,and 100 nM) was introduced in culture dishes.Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1),bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and Akt in cardiac supernatant and culture medium were assayed with ELISA methods.Results After co-culturing with FCS,beating myotubes were observed in 25.9 % BMSCs dishes after 1 to 2 weeks’ culture.The levels of TGF-β1 and BMP-2 in FCS concentrations were no more than that in young and adult cardiac supernatant.All BIO groups significantly enhanced the effects of FCS on differentiation of BMSCs into the cardiomyocyte-like cells (1 nM,83 %;10 nM,73 %;100 nM,100 %).Akt levels were higher in BMSCs cultural medium with FCS.Conclusions FCS could induce the differentiation of BMSCs into the cardiomyocyte-like cells.TGF-β1 and BMP-2 might not play a role in the differentiation of BMSCs induced by FCS.BIO enhanced the effects of FCS on the differentiation of BMSCs into cardiomyocyte-like cells,which might involve the Akt pathway.     

Melatonin protects bone marrow mesenchymal stem cells against iron overload‐induced aberrant differentiation and senescence

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are an expandable population of stem cells which can differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. Dysfunction of BMSCs in response to pathological stimuli contributes to bone diseases. Melatonin, a hormone secreted from pineal gland, has been proved to be an important mediator in bone formation and mineralization. The aim of this study was to investigate whether melatonin protected against iron overload‐induced dysfunction of BMSCs and its underlying mechanisms. Here, we found that iron overload induced by ferric ammonium citrate (FAC) caused irregularly morphological changes and markedly reduced the viability in BMSCs. Consistently, osteogenic differentiation of BMSCs was significantly inhibited by iron overload, but melatonin treatment rescued osteogenic differentiation of BMSCs. Furthermore, exposure to FAC led to the senescence in BMSCs, which was attenuated by melatonin as well. Meanwhile, melatonin was able to counter the reduction in cell proliferation by iron overload in BMSCs. In addition, protective effects of melatonin on iron overload‐induced dysfunction of BMSCs were abolished by its inhibitor luzindole. Also, melatonin protected BMSCs against iron overload‐induced ROS accumulation and membrane potential depolarization. Further study uncovered that melatonin inhibited the upregulation of p53, ERK and p38 protein expressions in BMSCs with iron overload. Collectively, melatonin plays a protective role in iron overload‐induced osteogenic differentiation dysfunction and senescence through blocking ROS accumulation and p53/ERK/p38 activation.     

Wnt/β-catenin信号通路介导糖基化终未产物对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增生及成骨分化的影响及可能机制.方法采用全骨髓法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs.将BMSCs随机分为成骨诱导液、BSA组、AGEs3组,Western blot法检测AGEs对BMSCs成骨分化过程中β-catenin、OSX、RUNX2、RAGE(AGE受体)蛋白表达量的影响,茜素红染色观察AGEs对BMSCs成骨分化过程中矿化的影响.抑制RAGE后实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluo-rescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot法再次测定上述指标水平.结果0.2 g/L AGEs作用于体外培养SD大鼠BMSCs,上调RAGE蛋白表达(0.88±0.04),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达降低(分别为0.21±0.02,0.25±0.03和0.21±0.01,P<0.05).RAGE中和抗体阻断RAGE作用后,AGE+RAGE中和抗体组RAGE蛋白表达下调(0.30±0.03),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达增高(0.90±0.02,0.84±0.03和0.88±0.02,P<0.05).结论AGEs通过Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs成骨分化.     

骨形态发生蛋白2在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的：观察骨形态发生蛋白2（BMP2）在骨髓间充质干细胞（BMSCs）向肝细胞分化中的作用。方法采用贴壁法分离培养大鼠股骨BMSCs ,将体外扩增的第3代BMSCs制作细胞爬片,并行肝细胞定向诱导。根据诱导因子不同分为：肝细胞生长因子（ HGF）组、HGF＋BMP2组、BMP2组及空白对照组。培养10 d左右收集细胞,观察各组细胞形态的变化,并采用ELISA法检测培养液上清中肝细胞特异性标志物甲胎蛋白（ AFP）、白蛋白（ ALB）,免疫细胞化学法检测诱导分化后细胞CK-18的表达。结果 HGF组和HGF＋BMP2组可检测到ALB、AFP及CK-18,且HGF＋BMP2组ALB、AFP及CK-18明显高于HGF组（P均＜0．05）。结论 BMP2不能单独诱导BMSCs向肝细胞分化,但能增强HGF诱导BMSCs向肝细胞分化的作用。     

犬骨髓间充质干细胞可诱导分化为组织工程瓣间质种子细胞

目的诱导分化骨髓间充质干细胞（BMSC）,探讨BMSC作为组织工程瓣膜的间质种子细胞的可行性。方法分离扩增犬BMSC,定向诱导分化为成纤维细胞,以隐静脉间质细胞为对照,比较两种细胞在形态学、增殖能力、胶原合成,以及两种细胞冻存和复苏率。结果光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,形态为梭形或多角型,血管间质细胞和第2代诱导BMSCs的倍增时间分别为38 h和36 h,诱导后的BMSC的冻存和复苏率、合成胶原能力与血管间质细胞之间无显著差异;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上。免疫组织化学结果显示种植后瓣膜上有间质细胞生长。结论BMSC诱导后可分化为成纤维细胞与静脉来源的间质细胞无显著差别,是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞。     

骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中TGF-β1、BMP-2分泌的影响

将大鼠分为空白对照组、经典组和骨碎补组,采用全骨髓贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测BMSCs成骨分化过程碱性磷酸酶活性、矿化结节、转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的分泌.结果显示,骨碎补总黄酮促进成骨分化同时增加TGF-β1、BMP-2分泌(均P＜0.05).骨碎补总黄酮可能通过上调二者的表达促进成骨,对骨质疏松症可能有积极的治疗意义.     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性鉴定

目的 建立人胎儿骨髓间充质干细胞(MMSCs)的分离、培养方法,观察MMSCs形态学、细胞生物学及细胞表型,以获得大量人源性MMSCs。 方法 收集12个人胎儿的骨髓,采用细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,用显微摄像、四甲基偶氮唑盐(MTT)和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫细胞化学鉴定其表型。 结果 0.5~2 h内尽快分离骨髓细胞,24 h换液后可获得约(300±8.0)个贴壁细胞,5个细胞以上的集落为(15±6)个;培养细胞在种植后1~3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入平台期;细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线基本类似,在达到对数生长期后,分裂相细胞明显减少。原代及传代培养显示,细胞分裂旺盛,可观察到干细胞特有的不均等分裂,5~7 d可传1代,连续传10代后,每个人胎儿来源MMSCs可扩增达1011-1012个细胞。MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。对传代MMSCs进行人甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18免疫细胞化学分析,细胞除表达微量甲胎蛋白外,不表达白蛋白和细胞角蛋白18。 结论 人胎儿MMSCs分离成分单纯,容易成功,增殖旺盛,在普通培养条件下不向肝细胞分化。MMSCs作为组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。     

粒细胞集落刺激因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖的影响及其在BMSC向神经元样细胞分化中的作用。方法取16只SD大鼠的骨髓,体外培养BMSC,采用差速贴壁法分离细胞,并进行鉴定。按不同浓度给予G-CSF,分为四组（G0-3组）,G0组不含G-CSF,设为阴性对照;G1～3组分别含G-CSF5、10、20ng/ml,按1×10^5/ml密度接种于平底96孔培养板中（每孔100μl）。MTT法测定各组加入G-CSF第1、3、5、7天吸光度（A值）的变化,观察G-CSF对BMSC增殖的影响。以碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h后,按神经胶质细胞衍化营养因子（GDNF）和不同浓度G-CSF组合分组（B1-5）进一步诱导,B1不含GDNF、G-CSF,镜下观察细胞形态变化。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测神经细胞标记物GFR-α1的表达。结果①在给予G-CSF第1、3、5、7天,G0组A值呈下降趋势（F=23.5083,P〈0.05）,G1～3组内A值呈上升趋势（F1=202.5940,F2=1301.8815,F3=1222.0091,均P〈0.05）;同一时间点组间A值比较,G2、G3组较G1组增高（P〈0.05）,G2与G3组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。②B2～5组细胞逐渐变成圆形、多角形,伸出树突,并且均表达GFR-α1,而B1组无类似改变,也不表达GFR-α1。比较各诱导组在同一时间点（诱导第1、3、7天）组间灰度比值,B2-5组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论G-CSF能促进大鼠BMSC的增殖,其适宜浓度为10ng/ml。联用GDNF和适宜浓度的G-CSF,比单用GDNF能更有效地诱导BMSC分化为神经元样细胞。