应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。     

sp3111RNAi转基因小鼠模型的评价以及sp3111下调表达对受精及早胚发育的影响

目的 评价sp3111 RNAi转基因小鼠模型的应用价值以及探讨SP3111蛋白降低表达对受精及早期胚胎发育的影响.方法 ①采用Real-Time PCR方法分别检测F1代和F4代转基因RNAi小鼠中sp3111 mRNA的表达变化,并比较2代间干扰效率的差异.②将精子分为实验组（F4代小鼠精子组）和对照组（野生小鼠精子组）,进行体外授精实验,观察受精率及碎裂胚胎的发生率.结果 ①F1代和F4代小鼠中干扰效率的差异无统计学意义（P〉0.05）.②实验组的正常胚胎与碎裂胚胎的形成率分别为34.48%和46.21%,与对照组相比均有显著差异（P〈0.05）.结论 ①RNAi转基因小鼠中RNAi诱导的转录沉默可稳定遗传至F4代.②SP3111下调表达对小鼠受精及早期胚胎发育有明显的影响.     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

转基因小鼠在生命科学中的研究进展

基因工程技术的飞速发展,使得利用转基因小鼠动物模型从生物整体上研究基因组的功能得以实现,并且其应用领域越来越广泛。将与疾病相关目的基因插入到与人类基因组高度同源的小鼠基因序列中构建转基因小鼠模型为研究人类疾病的分子机制提供了强有力的工具。传统的转基因技术由于技术受限影响其应用。近年来,新的转基因小鼠技术,如靶向转基因、快速定点转基因技术的应用为生命科学研究提供了更好的平台,将促进其进一步发展。     

转基因小鼠及其在免疫学研究中的应用

转基因小鼠(transgenic mice)是用注射等人工方法,将外源基因导入小鼠的受精卵中,再将它移植于假孕小鼠的输卵管内,使其历经正常的胚胎发育过程而培育成的携带外源基因的小鼠。这类小鼠不仅能表达外源基因,且可将其传给后代。1980年Gordon首次报道转基因小鼠后,迄今已有多种转基因小鼠问世,如:表达β-珠蛋白、人胰岛素、免疫球蛋白、细胞因子及其受体、乙型肝炎病毒以及小鼠和人类MHC抗原等基因的转基因小鼠。1989年10月在法国曾召开转基因小鼠在免疫学中应用的会议,讨论了许多关键问题,引起众多学者重视。目前,该类小鼠已成为现代免疫学研究中一类新型的实验动物。本文简述转基因小鼠的研究现状及其在免疫学研究中的应用。     

乙型肝炎病毒（adr亚型）转基因小鼠的研究

目的：制备含有2.0拷贝乙型肝炎病毒（HBV,adr亚型）基因组的转基因小鼠,为HBV相关医学问题的研究准备实验动物模型。方法：应用受精卵原核显微注射的方法,产生HBV转基因小鼠。用PCR, Southern-blotting杂交、放射免疫、免疫组织化学以及亚显微结构分析等方法,研究外源基因在转基因小鼠体内的整合、表达以及复制。应用常规病理切片及血清生物化学方法分析转基因小鼠的病理学改变。结果：得到了4只整合有HBV基因组的建立者小鼠,并证明HBV基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,在肝、肾组织内可特异性表达、复制,并在肝细胞内发现了Dane颗粒。转基因小鼠的肝、肾组织未见明显的病理学改变。结论：获得了HBV的转基因小鼠,其病毒基因可以表达,并有病毒颗粒形成。该小鼠对于HBV的各个基因产物是免疫耐受的,其基本生物学特性与人类的HBV携带者特征相似。     

RNA干扰上调天然免疫

目的:研究特异性RNA干扰对于天然免疫的上调作用。方法:分别分离WHV感染的土拨鼠和WHV转基因小鼠原代肝细胞,转染针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA。Northern blot和Real-time RT-PCR分别检测原代肝细胞中WHV、MxA、MHCⅠ、β-actin、GAPDH、IFN-β和IP-10的mRNA水平。结果:针对WHV、小鼠β-actin和GAPDH的siRNA抑制靶基因mRNA伴随MxA、MHCⅠ、IP-10等干扰素刺激基因的上调表达。这种干扰素刺激基因的上调表达只有在靶基因被特异siRNA降解时出现,呈剂量和沉寂效应依赖性,而且可以被siRNA特异性抑制剂所阻断。结论:RNAi上调天然免疫可能增强siRNA的抗病毒效应,有可能在抗病毒RNAi研究中发挥重要作用。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只(R3和R4)鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

HBsAg转基因小鼠模型的建立及其用于基因治疗研究初探

目的构建HBsAg转基因小鼠模型,并利用其进行基因治疗研究。方法显微注射外源基因pcDNAHBsAg至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。通过ELISA方法比较分析转基因小鼠经pcDNAHBsAg质粒基因免疫后抗体产生的情况。结果PCR结合Southern检测到了HBsAg阳性小鼠。基因免疫有抗体产生。结论得到的HBsAg转基因小鼠,基因免疫可诱发转基因小鼠产生抗体。     

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的 制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1,为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠,以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠.方法 重组构建含目的 基因的质粒pApoE-rtTA-tTS,应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵,再植入代母输卵管,出生小鼠经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定.结果 产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠.结论 成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠,为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础.