软骨细胞生物打印后细胞活力分析

目的：初步确立软骨细胞的二维生物打印方法,实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后的细胞活力。方法取原代软骨细胞,常规培养至第2代。实验分2组：打印组,快速成型组织打印机进行二维细胞打印,X轴间隔300μm, Y轴间隔1500μm,激光共聚焦显微镜观察,经生物打印后培养2 h,Live/Dead viability Kit测定细胞活力,激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况;对照组除细胞悬液不行打印,其余操作同打印组。结果打印组细胞激光共聚焦显微镜观察,“细胞墨滴”在二维组织中均匀分布,满足二维设计细胞打印的要求,每个“细胞墨滴”含细胞15-35个。细胞活力测试显示,打印组细胞活力与对照组无明显区别。结论通过生物打印技术可实现软骨细胞在二维平面上的定向、定量规则分布,为进一步的细胞三维打印乃至器官打印体系奠定基础。     

细胞打印的可行性研究

目的:探讨初步建立一个细胞打印系统,进行细胞无损伤打印的可行性。方法:常规培养人类宫颈癌细胞株Hela细胞,收获后做成细胞悬液代替喷墨封装入墨盒,改装喷墨打印机进行细胞打印,检测打印后细胞的活性,并与未经打印组细胞对照。结果:经过喷墨打印后细胞能够快速、精确的定位于目标区域,并且能够维持正常细胞形态、保持生物活力并继续生长、分裂增值。结论:细胞无损伤打印是可行的,为进一步的器官打印研究提供依据、探索方法。     

新型3D打印PLCL/Col多孔复合支架的制备及初步表征

背景:组织工程支架为组织缺损修复提供了一种可供选择的新方法。低温快速成型技术(LDM)是一种3D打印支架成型技术,具有显著的优势,可用于制备新型的多孔支架。目的:采用LDM制备新型3D打印PLCL/Col多孔复合支架。方法:采用新溶剂系统六氟异丙醇/1,4-二氧六环(HFIP/DIO)同时溶解天然材料Ⅰ型胶原蛋白(Col)和合成材料左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL),配置的溶液被LDM打印成PLCL/Col复合材料支架。通过扫描电子显微镜表征支架形貌结构,红外光谱检测支架组分,并对其进行初步力学观测。结果:通过形态结构表征证实3D打印复合支架有规则的相互连通的一级大孔隙,并且在所打印的线条内还有微米级的次级孔隙。虽然所打印支架有收缩,但其孔径尺寸较大,孔隙率均在85%左右。通过红外光谱检测证实Col的存在,证实所打印支架为复合材料支架。初步的力学观测表明所打印支架具有良好的力学性能和形变恢复能力。结论:所制备新型3D打印多孔PLCL/Col支架有良好的结构和力学性能,有用于组织缺损修复的潜能。     

基于Micro-CT的三维打印组织工程骨建模技术

目的建立符合组织工程要求支架材料的空间构型,建立支架材料CAD的微观建模。方法以Micro-CT所得的DICOM文件作为三维建模的输入文件,通过对生物骨骼组织构造研究,对DICOM格式的CT数据按灰度进行筛选,结合大量断面数据得到骨结构轮廓,进行微观仿生骨组织建模,得到骨骼微观结构的STL文件。结果建立基于通过Micro-CT所得的DICOM文件,可建立的骨骼微观结构的STL文件。结论Micro-CT所得仿生三维模型对三维打印组织工程骨建模技术有重要意义。     

快速成型技术在骨组织工程中的应用进展

慢性骨髓炎是骨科常见疾病,由于常有死骨和窦道形成,其治疗非常困难。骨组织工程的快速发展,为其治疗提供了新方法,快速成型(rapid prototyping,RP)技术是其中一种先进的制造技术,可以改变孔隙率和微孔的大小,从而适应不同组织工程材料的需要。本文就几种常见的快速成型技术在骨组织工程中的应用做一综述。     

3D生物打印结合干细胞在心胸外科领域的研究进展

随着再生医学的飞速发展, 以及生物材料和细胞技术的不断进步, 3D打印技术和干细胞运用到组织工程研究已经成为新的趋势。这一策略可以模拟原生组织或器官的原生态结构, 在心脏外科、肺部疾病、气道重建方面应用的研究日渐增多。该技术为未来器官移植学科的基础研究、疾病诊治等方面提供了新的思路。本文现通过综述近三年3D生物打印结合干细胞在心胸外科等领域中的前沿研究及临床应用, 评价其优势与不足, 总结今后的应用前景和发展趋势。     

3D生物打印复层空腔组织的初步研究

目的探讨利用生物打印系统一次性同步快速构建复层管状结构的可行性。方法将不同浓度的海藻酸盐和GelMA配比,进行生物力学检测,确定复合水凝胶打印的可行性;将水凝胶分别混合示踪剂及标记细胞,打印具有双层结构空腔管状结构,进行细胞活力检测并验证可灌注性。结果复合水凝胶杨氏模量为(8.78±1.73)×10-3 MPa,较单纯Gel MA的(2.38±0.69)×10-3 MPa和单纯海藻酸盐的(0.83±0.24)×10-3 MPa有明显统计学差异;同轴打印内外复层结构的壁厚分别为(62.06±0.45)μm和(93.78±10.25)μm;内、外管的管径分别为(663.66±51.74)μm和(976.84±63.44)μm;外管(红色微珠颗粒标识)和内管(绿色微珠颗粒标识)具有明显的分层差异;3T3细胞分别在内、外层同时打印后,体外培养1周,第1、3、7天细胞活力可以维持在(88.50%±5.8%)、(85.57%±6.22%)和(96.29%±2.64%);复层管状结构橙色溶液灌注,复层管壁完整性良好,未见明显液体渗出。结论本实验利用复合水凝胶构建复层空腔组织,打印后空腔组织内细胞能够长期存活,并具有一定的灌注功能。     

3D生物打印构建复层尿道组织的初步研究

目的探讨利用生物打印体外构建具有复层结构的尿道空腔组织的可行性。方法将7%GelMA和2%Alginate制备复合水凝胶,分别同绿色和红色的microbeads或2×106 cells/mL尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞混匀,通过本实验室改进的同轴多通道打印系统,以10～20μL/min的速度推进内、外层,以80～200μL/min的速度推进CaCl2,边打印边交联;打印后不含细胞的空腔结构,置于荧光显微镜下观察;打印后含有细胞的组织,以尿道上皮细胞和尿道平滑肌细胞混合培养液于六孔板内体外培养,分别于第0～7天live/dead染色检测细胞活力,F-actin染色检测细胞铺展情况;将培养24 h的打印后组织,予以红色颜料灌注。结果复合水凝胶混合microbeads后,荧光显微镜下可以清楚看到内、外双层结构,复层管腔的内、外径分别为(663.66±51.74)μm和(976.84±63.43)μm,内外亚层壁厚分别为(62.06±10.45)μm和(93.78±10.25)μm。尿道细胞在第0天和第7天的细胞活力分别为84.52%和86.26%,免疫荧光染色第7天F-actin染色铺展均匀,提示细胞铺展生长。灌注过程中,打印后空腔组织内红色灌注液可以顺利通过管腔结构,颜料并无外溢,管壁无破损。结论利用复合水凝胶和同轴多通道生物打印系统可以初步构建尿道空腔结构,打印后尿道细胞可在空腔结构内长期存活。     

3D打印技术在骨科的研究及应用进展

3D打印技术作为一种新型的快速成型及快速制造技术,受到医学学者的青睐。在骨科领域也得到了广泛的应用与发展,本文综述了3D打印技术在骨科的手术辅助、骨科材料及生物活性骨组织替代物等领域的应用进展,同时对其在骨科应用的未来进行展望。     

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的 探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制. 方法 采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养.于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果 ;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导培养7 d,ALP染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性.B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度.B、E、F组细胞培养7d,F组Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCNmRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组. 结论 LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达.     

缺氧对hBMSCs和胎盘来源MSCs增殖的影响

目的 比较hBMSCs和人胎盘基蜕膜MSCs(human placental dccidua basalis-MSCs,hPDB-MSCs)在化学缺氧条件下的增殖情况,为寻找组织工程新的种子细胞提供理论依据. 方法 采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs与hPDB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物;COCl2建立化学缺氧模型,MTT法检测两种细胞在不同CoCl2浓度(0、50、75、100、125、150、175、200μmol/L)和不同时间(6、12、24、48、72和96 h)的增殖情况. 结果 流式细胞仪检测显示hPDB-MSCs与hBMSCs均表达CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人类白细胞抗原ABC(human leucocyte antigen ABC,HLA-ABC),不表达CD34、CD40L和HLA-DR;但与hBMSCs相比,hPDB-MSCs阶段特异表达的胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(tumor rejection autigen, TRA)-1-60、TRA-1-81表达更高.化学缺氧12 h内,hBMSCs与hPDB-MSCs增殖均被抑制,12 h后均能促进增殖;与对照组比较,hBMSCs经150 μmol/L CoCl2作用24 h出现显著增殖(P<0.05),hPDB-MSCs在75μmol/LCOCl2作用12 h后出现显著增殖(P<0.05). 结论 与hBMSCs相比,hPDB-MSCs表达更高的胚胎干细胞特有表面抗原,同时对化学缺氧所致的增殖影响更为敏感,可能成为一种新的组织工程种子细胞来源.     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

人精子抗原基因表达克隆HSG_3生物学效应研究

本研究在已构建人睾丸ｃＤＮＡ表达文库，并用抗人精子抗体从中筛选出人精子抗原基因表达克隆（ＨＳＧ）的基础上，对其中ＨＳＧ３克隆进行了生物学效应的测定，结果显示①ＨＳＧ３克隆的溶原蛋白分子量为１４９ＫＤａ，并被兔抗人精子抗体识别。②ＨＳＧ３克隆表达抗原的特异抗体（ＨＳＧ３Ａｂ）对人精子ＳＩＴ和ＧＡＴ无明显影响，但能阻断人精子在顶体反应时，顶体后区ＣｏｎＡ受体的暴露。表明ＨＳＧ３克隆的表达抗原具有受精抗原的特性，能作为精子免疫避孕疫苗的候选成份。     

体外共培养hBMSCs和HUVECs对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:利用三维共培养技术体外构建含多种细胞的胰腺癌微组织,研究骨髓间充质干细胞(hBMSCs)、内皮细胞(HUVECs)对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响。方法:水凝胶复合细胞培养构建三维胰腺癌微组织模型。第一组:单纯Panc-1细胞;第二组:Panc-1细胞复合HUVECs;第三组:Panc-1细胞复合hBMSCs;第四组:Panc-1细胞复合HUVECs和hBMSCs。实时定量PCR分析胰腺癌肿瘤侵袭相关的基质金属蛋白酶(MMP-9)、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail基因。Western blot测定胰腺癌肿瘤侵袭相关的MMP-9、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail蛋白。结果:HUVECs共培养不影响MMP-9、E-cadherin和Snail基因和蛋白的表达(P>0.05),hBMSCs共培养促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05),同时加入两种细胞促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05)。结论:利用水凝胶为载体,加入骨髓间充质干细胞、内皮细胞与Panc-1胰腺癌细胞共培养,成功构建复杂的胰腺癌肿瘤微组织。通过对胰腺癌上皮间质转化相关机制研究,发现骨髓间充质干细胞通过调节MMP-9和上皮间质化对胰腺癌的侵袭行为起重要作用。     

几丁质生物学特性研究

对由蚕蛹中提纯的几丁质材料进行生物学特性研究,结果证明几丁质具有无毒性、无刺激性、无免疫抗原性、无热源反应、不溶血、Ames试验阴性,是一种组织相容性良好的新的体内植入性生物材料。     

成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性

目的探讨成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性. 方法取2周龄乳兔颅盖骨及肾脏皮质传代培养制备成骨细胞(A组)、血管内皮细胞(B组)及成骨细胞与血管内皮细胞联合培养(C组),用Ⅰ型胶原和血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞和血管内皮细胞,倒置相差显微镜和组织学染色观察细胞的生长特性和细胞相容性,检测碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)活性,观察血管内皮细胞对成骨细胞产生的ALP活性有无影响,MTT法检测细胞活力,分析细胞生长和增殖情况. 结果免疫细胞化学染色证实,培养的细胞为成骨细胞和血管内皮细胞.倒置相差显微镜、HE和Masson染色均显示两种细胞混合生长良好.ALP检测结果:C组ALP活性明显高于A组和B组(P＜0.01),A组高于B组(P＜0.05).MTT检测结果表明:C组细胞早期增殖较慢,而后期增殖较快. 结论成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的相容性,血管内皮细胞能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力.联合培养细胞具有很强的增殖潜能.     

兔肌腱细胞与成纤维细胞生物学特性研究

为了研究在体外培养条件下，肌腱细胞与成纤维细胞的生物特性，按Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ方法作兔肌腱细胞与皮肤成纤维细胞体外培养，观察细胞形态、贴壁时间及延展时间。采用免疫组织化学的方法对细胞合成胶原的类型进行了测定。结果表明：两种细胞未贴壁前均呈圆形，贴壁后呈梭形或多角形。成纤维细胞的贴壁时间、延展时间较肌腱细胞快；贴壁后细胞群体的排列方向，肌腱细胞群体排列趋于一致、规则，成纤维细胞排列呈不规则。肌腱细胞合成Ⅰ型胶原，成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原。根据细胞的贴壁时间、延展时间、排列方向及合成胶原类型，可以区分肌腱细胞及成纤维细胞。     

关节游离体软骨细胞生物学特性的初步观察

目的观察关节游离体软骨细胞的生物学特性，寻找组织工程软骨种子细胞来源。方法分别取游离体软骨标本5例，正常软骨标本2例和骨关节炎软骨标本6例，组织学观察其细胞分布、尿嘧啶脱氧核苷末端转移酶介导的三磷酸脱氧核苷缺口标记法观察细胞凋亡，细胞分离培养观察原代软骨细胞形态，并进行比较。结果与正常软骨、骨关节炎软骨比较，游离体软骨细胞分布密度较高，细胞凋亡明显．体外培养时原代细胞已呈成纤维细胞样形态。结论游离体软骨细胞已具有成纤维细胞特性，不宜直接作为组织工程的种子细胞来源。     

兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性.方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态.分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究.结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5 d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8 d细胞生长进入指数生长期;约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变.髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%.髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性:HE染色见细胞核、细胞质着色明显.第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅.MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符.透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀.结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据.