实时荧光定量PCR分析细菌的组成及数量

目的采用实时荧光定量PCR的方法对酸奶中的乳酸杆菌和双歧杆菌进行检测。方法通过标准菌株的培养和标准曲线的构建,建立检测乳酸杆菌和双歧杆菌的实时荧光定量PCR的检测方法,对送检的4组样品进行检测。结果通过标准曲线的构建得到乳酸杆菌和双歧杆菌的标准曲线方程：乳酸杆菌：Y=-3.293x＋14.52;其r值为0.999;双歧杆菌为：Y=-3.464x＋17.42,其r值为0.998,不同品牌的酸奶中,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量存在很大差异,由于保密原因,本文将酸奶品牌简称为1、2、3、4,1和2两个品牌的酸奶中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均高于3和4号两个品牌,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论实时荧光定量PCR可以准确的对样品中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量进行检测。     

肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶检测及药敏分析

目的 检测肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及耐药特点,指导临床更有效的使用抗生素治疗感染性疾病.方法 用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)1999年规定的试验检测78株肠杆菌科细菌是否产ESBLs,用纸片扩散法作细菌的药敏试验.结果 ESBLs总阳性率为35.9%.大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌...     

探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值

目的:探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值。方法:选择2021年4月至2023年4月我院收治的120例疑似慢性乙型病毒性肝炎患者为研究对象,分别采用实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附法(ELISA)对所有患者HBV-DNA含量进行检测。以试纸法检测结果为标准,比较实时荧光定量PCR、ELISA检测结果的一致性;比较实时荧光定量PCR、ELISA对慢性乙型肝炎的诊断效能;比较不同HBV感染状态下HBV-DNA含量的差异。结果:120例疑似慢性乙型肝炎患者经试纸法检查确诊为慢性乙型肝炎107例。Kappa检验分析结果显示,实时荧光定量PCR检查结果与试纸法检查结果具有高度的一致性(Kappa值=0.897,P<0.05)。实时荧光定量PCR对慢性乙型肝炎的诊断灵敏度、特异性与准确率均高于ELISA(P<0.05)。大三阳HBV-DNA含量均高于小三阳与急慢性感染期(P<0.05);小三阳HBV-DNA含量与急慢性感染期比较无明显差异(P>0.05)。结论:实时荧光定量PCR在慢性乙型肝炎诊断中的应用价值较高,不但能完成疾病的准确诊断,还能通过对...     

细胞因子实时定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立细胞因子mRNA实时定量PCR的检测方法,并探讨人单个核细胞(PBMC)在激发型CD3单克隆抗体作用下,细胞因子mRNA的表达.方法 分离健康个体的PBMC,体外与激发型CD3单克隆抗体共培养,应用实时定量PCR检测不同共培养时间点Th1型(IL-2,IFN-γ)和Th2型(IL-10)细胞因子mRNA的表达.结果 激发型CD3抗体能显著上调PBMC胞浆IL-2,IFN-γ和IL-10 mRNA的表达.在共培养的12 h,IL-2 mRNA的含量显著上升并达到峰值14 000 copies/ml,随着培养时间的延长快速下降.IFN-γ和IL-10 mRNA在共培养的24～48 h达到峰值,分别为110 000 copies/ml和15 000 copies/ml.不同细胞因子其胞浆mRNA水平的基础值有明显差异.结论 实时定量PCR能在基因转录水平敏感和特异地反映微量生物活性因子的表达和调节.因此,该技术在基础和临床免疫研究中,具有良好的应用价值.     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎血清DNA的临床观察

目的:探讨乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒DNA定量与乙型肝炎标志物关系.方法:采用荧光探针杂交技术为基础的实时荧光定量PCR检测259例乙型肝炎患者血清中DNA含量,与HBV标志物作对比分析.结果:血清HBeAg阳性组HBV-DNA阳性率为98.6%,HBeAb组阳性率为61.5%;HBeAg组阳性率含量明显高于HBeAb阳性组.结论:实时荧光定量PCR检测具有较高的灵敏度和特异性,定量准确、结果可靠,为临床了解病毒复制情况,制定治疗方案及疗效观察提供了确切依据.     

实时荧光定量PCR法检测中药制剂中沙门菌

目的 采用实时荧光定量PCR技术,建立一种中药制剂中沙门菌的快速检测方法。方法 将中药制剂加入适量的胰酪大豆胨液体培养基中进行增菌后,取增菌液以热裂解法提取总DNA,采用实时荧光定量PCR法特异性检测沙门菌。结果 建立了中药制剂中沙门菌的实时荧光定量PCR检测法,检测可在24 h内完成,灵敏度达每10 g（10 mL）供试品1 cfu,特异性为100%,采用该方法检测18批次样品结果与药典方法一致。结论 采用实时荧光定量PCR法可明显缩短中药制剂中沙门菌检测周期,具有良好的灵敏度和特异性,可作为药典检测方法的有效补充。     

实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒HPV 23分型的临床研究

目的：建立实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒HPV 23分型的方法。方法采用实时荧光定量 PCR检测 HPV DNA。结果在60例检测患者中,有19例患者检测出HPV人乳头瘤病毒感染阳性。结论实时荧光定量PCR方法检测人乳头瘤病毒灵敏度高、特异性强,可以为宫颈癌的预防、发展监测、手术预后等提供重要的临床指导。     

产超广谱β-内酰胺酶细菌的检测及耐药性分析

目的对超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌进行检测,为防止其传播及治疗提供依据。方法应用纸片扩散确证法检测ESBLs,K-B法做药敏试验。结果在227株肠杆菌科细菌中检出ESBLs细菌89株,它们对几乎所有的β-内酰胺酶类抗生素产生交叉耐药,对氨基糖苷类,喹诺酮类部分耐药,对磺胺类全部耐药,对亚胺培南的敏感率为100％。结论产ESBLs细菌具有较高的交叉耐药性,通过耐药质粒可传递给其他细菌,实验室应积极开展ESBLs的检测,并向临床及时报告。     

临床产ESBLs细菌耐药特性及其基因分型的研究

目的了解并研究产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌流行及耐药特点,应用聚合酶链反应(PCR)对产ESBLs细菌进行初步分型.方法先后用头孢硝噻吩及纸片扩散初筛法、纸片扩散确认法从临床分离的肺炎克雷伯菌及大肠埃希氏菌中检测产ESBLs菌株,用微量稀释法测定不同类抗生素对产ESBLs菌株的MIC值,并用聚合酶链反应对ESBLs基因进行初步分型.结果我院临床分离肺炎克雷伯菌产ESBLs率为16.7%、大肠埃希氏菌产ESBLs率为12.4%.产ESBLs细菌对青霉素类及三代头孢菌素类耐药率约为70%-100%.加用酶抑制剂后它们的耐药率降为2%-60%左右.它们对复方磺胺、环丙沙星及头孢吡肟的耐药率分别为69.23%,56.41%和20.51%.但它们对阿米卡星的耐药率为12.82%.而非典型β-内酰胺类抗生素头孢西丁、头孢美唑及拉氧头孢对产ESBLs菌株的敏感率分别为94.88%,92.32%,和97.44%.碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南表现了最高的敏感率末发现耐药菌株.ESBLs对单独头孢哌酮的水解率为43.93%,而当结合了舒巴坦、克拉维酸及三唑巴坦时对头孢哌酮的水解率分别下降为20.91%,18.13%及15.27%.产ESBLs肺炎克雷伯菌中产SHV型,TEM型,及SHV和TEM型β-内酰胺酶基因的百分率依次为41.66%,8.33%和50%,而在大肠埃希氏菌中百分率依次为96.3%,0%和3.7%.结论产ESBLs细菌对青霉素、头孢菌素类耐药率较高,并对不同类抗生素有多重耐药的特点.它们对头孢霉素类及氧头孢烯类表现出相当高的敏感率;碳青霉烯类是对产ESBLs细菌最有效的药物.酶抑制剂对产ESBLs细菌的体外效果以头孢哌酮共同底物的情况下为三唑巴坦略优于克拉维酸,但二药都强于舒巴坦.产ESBLs细菌均携带SHV或TEM型β-内酰胺酶基因,其中大肠埃希氏菌绝大部分产TEM型β-内酰胺酶,而对于产ESBLs肺炎克雷伯菌则主要以产SHV型β-内酰胺酶为主.     

产超广谱β-内酰胺酶细菌的检测及耐药性观察

目的 探讨大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率及其耐药现状，为临床合理用药提供依据。方法 对54株大肠埃希氏菌和74株肺炎克雷伯氏菌采用纸片扩散初筛法和复合纸片表型确证试验进行检测。结果 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)发生率大肠埃希氏菌为40．7％，肺炎克雷伯氏菌为56．8％，超广谱β-内酰胺酶阳性菌株对多种抗生素耐药性高。结论 大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏茵超广谱β-内酰胺酶发生率高，临床应慎用三代头孢菌素和氨曲南。     

尿液荧光定量聚合酶链法测定人巨细胞病毒的临床价值

目的 探讨荧光定量聚合酶链法在婴幼儿尿液人巨细胞病毒检测中的临床价值.方法 选择患者40例,所有患者入院后进行抗病毒及对症支持治疗,应用荧光定量聚合酶链法测定患者治疗前后的人巨细胞病毒-DNA、人巨细胞病毒-IgM,并比较治疗前后不同时间段尿液中的人巨细胞病毒-DNA水平.结果 治疗后,人巨细胞病毒-DNA、人巨细胞病毒-IgM阳性率均低于治疗前（P＜0.05）,荧光定量聚合酶链法测定其阳性率均＞90％.治疗后晨尿、上午随机尿液及下午随机尿液中人巨细胞病毒-DNA水平低于治疗前同时段（P＜0.05）.结论 荧光定量聚合酶链法在早期诊断婴幼儿尿液人巨细胞病毒感染中具有重要价值.     

SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台的建立

目的建立SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。方法通过摸索SYBRGreen工作液的配制方法,经典PCR检测HBVDNA方法转为SYBRGreen实时荧光定量PCR方法及建立大鼠TGF-bate1mRNA表达水平的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法。结果SYBRGreenⅠ工作液,40×H2O溶液稳定性好,最佳反应浓度为1∶10000。HBVDNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法,最佳的MgCl2反应浓度4.0mmol,引物浓度0.5μmol,81℃时收集荧光信号。定量分析用标准曲线斜率为-3.32,相关系数为-0.994,误差为0.016。大鼠TGF-bate1表达水平的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法,TGF-bate1和Bate-actin的最佳MgCl2反应浓度均为3.5mmol,引物浓度前者为0.8μmol,后者为0.5μmol,在87℃时收集荧光信号。靶基因TGF-bate1mRNA的相对量用下述公式计算:(1+Etgf)Ct1/(1+Eact)Ct2。结论初步建成了可检测DNA和mRNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。     

人巨细胞病毒感染的核酸检测比较及对肝脏损伤的研究

目的：应用实时荧光定量聚合酶链反应（ FQ-PCR）检测疑似人巨细胞病毒（ HCMV）感染的患儿尿液、血液及对应母亲乳汁中HCMV DNA含量,探讨其在HCMV感染诊断中的价值及对肝脏损伤情况。方法应用FQ-PCR方法检测104例疑似HCMV感染患儿新鲜尿液上皮细胞、血液及其对应的母亲乳汁中的HCMV DNA拷贝数,并同时检测患儿血液中天冬氨酸转氨酶（ AST）、丙氨酸转氨酶（ ALT）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素水平。结果尿液、血液标本阳性检出率分别为52．9％（55/104）,24．0％（25/104）,尿液阳性率明显高于血液阳性率,二者差异有统计学意义（P＜0．01）。乳汁标本阳性检出率为81．7％（85/104）,对应患儿血液和/或尿液阳性率为62．4％（53/85）,二者差异有统计学意义（P＜0．05）。且患儿HCMV拷贝数越高,肝脏损伤的可能性越大。结论婴儿尿液中HCMV DNA检测率明显高于血液的检出率,且拷贝数越高,肝功能损伤的可能性就越大。尿液HCMV DNA检测对于诊断婴儿HCMV感染和治疗监测具有重要的价值。肝功能的检测对判断HCMV感染严重程度有一定的参考价值。     

大肠癌组织中环氧化酶2基因表达的实时定量PCR检测

目的探讨环氧化酶2(COX-2)在大肠癌发生和发展中的意义。方法建立实时定量RT-PCR方法,采用LightCycler PCR仪检测了28例大肠癌COX-2 mRNA及内参GAPDH mRNA的表达,以COX-2N=(COX-2拷贝数/GAPDH拷贝数)×103表示COX-2 mRNA表达水平。结果肿瘤组织COX-2 mRNA与正常组织表达水平有极明显差异(P<0.05),转移组织较正常组织COX-2mRNA表达有明显差异(P<0.01)。结论COX-2参与了大肠癌的发生和发展,并起到了重要作用。     

Highly specific,quantitative polymerase chain reaction probe for the quantification of human cells in cynomolgus monkeys

Quantification of human cells may be performed using quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In preclinical studies, the human Alu sequence is widely used as biomarker for human DNA. However, because the Alu gene is shared by primates, its use is limited to non-primate studies. The biodistribution of human cells in primates is also necessary for translational studies. Therefore, we aimed to design a novel, human-specific primer/probe that enables the quantification of human cells in primates and other animal models. A novel primer/probe set was successfully designed based on highly repetitive LINE1 sequences. qPCR efficiency (94.95–99.21%) and linearity of calibration curves (r² = 0.996–0.999) were confirmed in tissue homogenates of cynomolgus monkey. The lower limit of detection was 10 cells per 15-mg tissue sample, a sensitivity that is equivalent to existing Alu primers/probes. The set was also effective in other animal models such as mice, rabbits, pigs, and common marmosets.To our knowledge, this is the first study describing the successful design of a human-specific qPCR primer/probe for human cell quantification in various animals, including non-human primates, using LINE1 sequence. The excellent selectivity, sensitivity, and versatility of the LINE1 primers/probes make it a promising quantification tool in preclinical biodistribution studies.     

CTX-M-15型ESBLs的传播机制和基因环境的研究进展

CTX-M-15是一种同时具备水解头孢噻肟和头孢他啶能力的超广谱β-内酰胺酶,目前在世界各地广泛、快速的传播,甚至在局部地区出现暴发流行。本文就CTX—M-15酶的分子特点,流行病学及CTX-M-15编码基因（blaCTX-M-15）及其基因环境等研究方面作一综述。     

荧光定量PCR检测HCV核酸提取法临床价值分析

目的使用RQ-PCR比较氯仿-异丙醇法和核酸分离柱法提取HCVRNA的临床价值。方法分别用两种核酸提取法提取相同患者的HCVRNA后,采用RQ-PCR技术检测HCVRNA含量,对两种方法的提取效率和重复性进行对比。结果两种方法均能较好地提取RNA,且提取效率相近（P〉0.05）,但是核酸分离柱法在重复性上更加优于氯仿-异丙醇法。结论两种方法均可被临床采纳,但是核酸分离柱法重复性更高,且毒性低,值得推广。