骨髓间充质干细胞在肌组织局部成肌分化的实验研究

目的 探讨骨髓问充质干细胞(marrow mesenchmal stem cells，MSCs)移植至肌肉组织后的原位成肌分化情况。方法 以BalB／C雌性小鼠36只，建立放射损伤合并创伤(切割伤 冻伤)的严重肌损伤模型，再将分离扩增的雄性小鼠的单纯MSCs及经10μmol／L 5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza—CR)诱导24h的MSCs以局部注射移植法，植入雌性小鼠正常肌肉组织和创伤后的肌肉组织，采用荧光标记的原位杂交法、免疫组织化学法在移植后1、3、6、9、12及15d检测植入的MSCs在肌肉组织原位的数量变化及成肌分化情况。结果 植入的MSCs数量随着时相延长而减少；单纯MSCs植入正常肌肉组织15d，5-Aza-CR诱导后的MSCs植入正常肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性；5-Aza-CR诱导的MSCs植入损伤肌肉组织3d，单纯MSCs植入损伤肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性。结论 MSCs局部移植至肌肉组织局部可实现成肌分化，但经5-Aza-CR诱导后的MSCs植入损伤肌肉组织的MSCs其成肌分化时相明显早于单纯MSCs植入正常肌组织的MSCs。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性。方法抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离纯化MSCs，培养扩增后。用含EGF的不同介质诱导，观察细胞形态的变化，免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达。结果免疫组织化学染色显示EGF诱导后3d MSCs角蛋白表达较弱，7d角蛋白表达增强。流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少(3％)，7d表达角蛋白的细胞数量明显增加(13％)。结论MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的初步实验研究

目的:探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性.方法:抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离纯化MSCs,培养扩增后,用含EGF不同介质诱导,观察细胞形态的变化,免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达.结果:免疫组织化学染色显示EGF诱导后3dMSCs角蛋白表达较弱,7d角蛋白表达增强.流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少,7d表达角蛋白的细胞数量明显增加.结论:MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞.     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的显微形态学研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化过程中的显微形态学改变及其意义,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源.方法 从人脐带华尔通氏胶分离、培养MSCs,倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞分化前后细胞形态的变化及超微结构,用免疫组化的方法检测分化的心肌样细胞是否表达心肌肌钙蛋白I(troponin I)、心肌肌钙蛋白T(troponin T)和心肌结蛋白(desmin). 结果 扫描电镜观察到人脐带MSCs经5-aza和DMSO诱导后体积变大变长,呈杆状细胞且细胞浆中可见肌丝样结构出现;透射电镜可以观察分化的细胞浆中有肌丝的存在.同时分化的细胞表达心肌细胞的标记troponin I、troponin T和desmin. 结论 人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,可以作为心肌细胞移植的来源.     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷联合诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件。方法取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中，置于37C、5％CO2恒温培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察，细胞布满瓶底即为1代，取第3代MSCs，以5-氮杂胞苷10μmol／L、成肌分化因子0．1ng／ml、转化生长因子β1 0.1ng／ml、胰岛素样生长因子12ng／ml进行联合诱导，使之分化。诱导后第9天，收集细胞，行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞。结果原代培养的MSCs呈贴壁生长，3～5d呈集落样生长，5～7d后有体积不等的多突成纤维细胞、较大的扁平多角形细胞、中等的多角形细胞和较小的三角形细胞。培养12d后，细胞融合，铺满瓶底，MSCs形态变化不明显。联合诱导后，部分细胞死亡，生长缓慢；7d后见细胞明显增殖，体积逐渐增大，呈椭圆形、梭形或不规则形状；14d后，大量增殖的长梭形细胞开始增多；18～22d后，肌管数量增多，体积增大，核数亦明显增多，初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列，间隔分布。MSCs免疫组织化学法测定CD44反应阳性，胞质呈棕褐颗粒，核周明显，CD34呈阴性反应；诱导后MSCs结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。流式细胞仪测定MSCs和诱导后MSCs大部分处于G0／G1期，分别占79．4％、62．9％，而G2／S／M期仅占20．6％、36．1％。根据MTT绘制生长曲线，可见MSCs生长速度明显高于诱导后的MSCs。两种细胞并未达到平台期，都有继续增殖的趋势。结论在体外，MyoD、5-氮杂胞苷可以诱导MSCs向骨骼肌细胞定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后MSCs增殖期比例大，向骨骼肌细胞分化纯度更高。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

心肌或"心肌样"环境而不是化学物质诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化研究

目的 比较心肌或“心肌样”环境与胞嘧啶类化学物质5-氮胞苷对骨髓基质细胞(MSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法 用不同浓度(3、5、10μmol／L)的5-氮胞苷以各种方法(一次处理与反复处理)诱导MSCs，连续观察30d。采用免疫荧光技术检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)及肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)的表达，并用心室肌特异性肌球蛋白轻链(MLC2v)启动子(250bp)控制的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)报告基因表达技术从转录启动水平进行检测；将MSCs与心肌细胞共培养或移植入大鼠心肌内。检测MHC及TnⅠ表达。结果 5-氮胞苷处理过的MSCs培养物中未见细胞搏动、肌管形成、MHC和TnⅠ表达，亦无MLC2v转录启动阳性细胞出现；但在共培养及体内移植实验中，检测到心肌特异性蛋白在MSCs中的表达。结论 体外5-氮胞苷处理不能诱导MSCs表达心肌特异性蛋白；但MSCs与心肌细胞直接接触可向心肌细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察

目的:研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)加条件培养基体外诱导大鼠 MSCs 向表皮细胞定向分化的可行性。方法:采用 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓 MSCs,免疫细胞化学染色及流式细胞仪进行鉴定。传至第3代的大鼠 MSCs 用表皮生长因子(EGF)、条件培养基等定向诱导 MSCs 分化为表皮细胞;免疫细胞化学对细胞角蛋白 CK5/8、19(Cytokeratin5/8、19)阳性表达细胞进行检测。结果:从大鼠骨髓中分离培养的 MSCs 增殖能力强,细胞表面标志 CD34、CD45阴性,CD29、CD44阳性,流式细胞仪检测显示细胞纯度高,诱导后7d 细胞免疫化学显示角蛋白5/8、19染色阳性,具有表皮细胞特征。结论:从大鼠骨髓中分离培养出的问充质干细胞,具有自我更新和增殖能力强的特点,经诱导可定向分化表达角蛋白。     

分层共同培养诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的 探讨体外联合HaCaT细胞共同培养诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向表皮细胞分化的可行性.方法 用聚碳酸酯细胞插入板分层后联合共同培养HaCaT细胞与MSCs,观察培养3、6、9d后的细胞形态,进行角蛋白(CK-19、CK-10)、整合素(α6、β1)染色并用流式细胞仪统计细胞阳性率.结果 共同培养后细胞形态变化明显,共培养3、6d后表皮细胞标志物CK-19、α6整合素、β1整合素免疫荧光染色阳性,细胞阳性率分别为9.3％、8.2％、11.5％和21.7％、34.1％、39.6％,CK10表达呈阴性;共培养9d后CK-19、α6整合素、β1整合素、表达较前减少,阳性率为12.2％、18.6％、16.3％,CK1O出现阳性表达,细胞阳性率为10.7％.结论 分层联合HaCaT细胞共同培养可以诱导骨髓干细胞向表皮细胞进行分化.     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MsCs)定向分化为心肌细胞的可行性，建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MsCs；用5-氮杂胞苷(0．1、1、5、10、50和100μmol/L)定向诱导24h，分别在诱导培养的第14d和21d，检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs，移植于急性梗死心肌组织内，4周后进行组织学和免疫组织化学染色，并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导，培养21d后，5和10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白，并一些细胞自发性跳动；细胞移植4周后，在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。结论MsCs可以分化成心肌细胞。     

骨髓间质干细胞体外转化为肌细胞的研究

目的 采用骨髓间质干细胞（MSCs)体外转化为肌细胞，为心衰的干细胞移植治疗提供新的细胞材料，方法 抽取贵州香猪骨髓液3ml，按照Wakitani的方法培养骨髓间质干细胞，经5-氮胞苷（5-azacytidine)刺激24h后，进行结蛋白（desmin)，肌球蛋白重链（MHC）免疫组织化学，透射电镜鉴定。结果 骨髓间质干细胞经5-aza刺激后，部分细胞呈梭形，结蛋白，肌球蛋白重链阳性，有多核肌管形成，透射电镜可见明显的肌丝形成，结论 骨髓间质干细胞可在体外的环境下向肌细胞转化。有望成为心衰干细胞移植的较理想细胞材料。     

肌细胞生成素在分化培养人体肌卫星细胞表达的研究

目的 研究肌细胞生成素(myogenin)在人体肌卫星细胞分化培养中的表达规律，探索肌细胞生成素在肌卫星细胞分化中的作用。方法 取6例正常成人的骨骼肌，消化、分离肌卫星细胞，肌卫星细胞生长培养后进行分化培养。在分化培养过程中，观察肌卫星细胞形态，计算其融合率，应用半定量RT—PCR技术检测细胞总RNA中肌细胞生成素mRNA的表达量。结果 在肌卫星细胞分化培养过程中，肌细胞生成素mRNA的表达增加，其规律与肌卫星细胞分化、融合相一致。结论 肌细胞生成素参与人体肌卫星细胞分化过程。     

骨髓间质干细胞体外定向肌样分化的研究

目的 研究兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在体外定向肌样分化的情况。方法 取兔胫骨骨髓，分离并培养骨髓间质干细胞，用5—氮杂胞苷苦(10μmol/L)定向诱导，分别在培养的第7、14、2l、28天用免疫组织化学的方法检测细胞中的肌球蛋白重链，取未经5—氮杂胞苷诱导正常培养的细胞为对照组。结果 兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在其培养的第21、28天免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阳性，而在其培养的第7、14天以及对照组，免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阴性。结论 骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞，在5—氮杂胞苷的定向诱导下，可以肌样分化。     

Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model

BACKGROUND: We evaluated the effect of autologous marrow stromal cells (MSCs) on neovascularization and blood flow in an animal model of chronic limb ischemia. METHODS: Chronic hind limb ischemia was created by ligating the left common iliac artery of male Lewis rats. Three weeks after ligation, 5.0 million LacZ+MSCs (n = 10) or culture medium (n = 10) were injected into the anteromedial muscle compartment of the left thigh. At 4 and 6 weeks after injection, half the animals (n = 5) from each group underwent femoral artery ultrasonic blood flow measurements of the ischemic and nonischemic limbs to obtain a flow ratio. The animals also underwent angiography and measurements of blood vessel density and arteriolar density. Qualitative histologic assessment of the limb muscles was performed. RESULTS: LacZ+MSCs were found to differentiate into endothelium (F VIII+), vascular smooth muscle (positive a-smooth muscle actin), skeletal muscle (positive desmin), and adipocytes. Ischemic hind limbs where MSCs were implanted had greater vascular density and arteriolar density than control limbs (p < 0.001). Femoral artery flow index (left femoral artery flow/right femoral artery flow) was 0.89 +/- 0.12 and 0.90 +/- 0.06 for rats injected with MSCs measured at 4- and 6-weeks, respectively, compared with 0.50 +/- 0.15 and 0.50 +/- 0.10 for the control rats (p < 0.001). Angiography demonstrated reconstitution of the left femoral artery in rats that received MSC implantation through pelvic and abdominal wall collateral formation. CONCLUSIONS: Local MSC implantation induces a neovascular response resulting in a significant increase in blood flow to the ischemic limb. Marrow stromal cells are also capable of spontaneously regenerating the various components of muscular tissues.     

Potential differentiation of human mesenchymal stem cell transplanted in rat corpus cavernosum toward endothelial or smooth muscle cells

One of the causes of erectile dysfunction (ED) is the damaged penile cavernous smooth muscle cells (SMCs) and sinus endothelial cells (ECs). To investigate the feasibility of applying immortalized human mesenchymal stem cells (MSCs) to penile cavernous ECs or SMCs repair in the treatment of ED, the in vivo potential differentiation of the immortalized human MSCs toward penile cavernous endothelial or smooth muscle was investigated. One clone of immortalized human bone marrow mesenchymal stem cell line B10 cells via retroviral vector encoding v-myc were transplanted into the cavernosum of the Sprague-Dawley rats and harvested 2 weeks later. The expression of CD31, von Willebrand factor (vWF), smooth muscle cell actin (SMA), calponin and desmin was determined immunohistochemically in rat penile cavernosum. Multipotency of B10 to adipogenic, osteogenic or chondrogenic differentiation was found. Expression of EC specific markers (CD31 or vWF protein) and expression of SMC specific markers (calponin, SMA or desmin protein) were demonstrated in grafted B10 cells. When human MSCs were transplanted into the penile cavernosum, they have the potential to differentiate toward ECs or SMCs. Human MSCs may be a good candidate in the treatment of penile cavernosum injury.     

人体肌卫星细胞培养的实验研究

目的 了解人体肌卫星细胞在体外培养条件下的生物学特性。方法 标本取自创伤病例的四肢骨骼肌,消化、提纯后,在生长培养液内培养10天,细胞生长至汇合后分化培养5天。倒置显微镜观察,绘制细胞生长曲线,计算细胞融合率,结蛋白免疫细胞化学方法（ABC）法鉴定肌卫星细胞。结果 细胞消化、提纯后纯度为90％。在生长培养液内肌卫星细胞分裂增生;在分化培养条件下,汇合状态的肌卫星细胞发生融合,形成肌管,分化培养24小时细胞融合率开始明显增加,分化72小时融合率达到高峰。结论 人体肌卫星细胞在适当的培养条件下可以增生、分化,形成肌纤维。结蛋白免疫细胞化学染色是早期鉴定肌卫星细胞的有效方法。