大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景：组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径，克服了传统治疗方法的不足、目的：探讨分离骨髓间充质干细胞，在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法。设计：完全随机实验单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研率方法：实验于2002-08／2003-04在广西医科大学完成。实验动物选择新生断奶SD大鼠20只抽取大鼠四肢骨髓，Perrcoll梯度分离液离心分离结合贴擘筛选法得到间充质下细胞，在含体积分数0．15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱内培养10～14d。传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液（含转化生长因子β1 10μg/L．地塞米松10^-7mol/L维生素C50mg／L）对其进行诱导培养。主要观察指标：观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况结果：所有20只SD大鼠全部进行分析观察，无一例脱失：①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞，保持了细胞的活性。②骨髓间充质干细胞原代培养晕均匀分布的集落样生长，呈长梭形；传代培养中形态特性无明显变化，细胞增殖周期缩短，细胞均质性明显提高。③诱导后的细胞由梭形向多角形转变，Ⅱ型胶原免疫组化阳性。④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质十细胞②间充质于细胞在体外特定培养条件下能大量增殖，实现数量扩增、③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软骨特异性基质，可成为软骨组织工程理想的种子细胞。     

Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景:骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的:比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论:采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景：骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的：比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论：采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的：探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。 方法：实验于2005—09／2006—02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊，雌雄不拘，体质量20—30kg。①采用Percoll分离液，经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞，体外培养至第3代时，将骨髓间充质干细胞分为2组，实验组细胞贴壁后更换培养液，以无血清H—DMEM特定培养液诱导（内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10^-7mol／L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生索C50mg／L），对照组加含10％胎牛血清的L—DMEM培养液，3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构，分别在诱导后的第7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。 结果：①相差显微镜观察实验组诱导14d后，细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变。并出现聚集成堆现象，而对照组细胞仍保持均一的梭形，增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多，胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体，表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑，胞核呈条状，核壁有许多皱裴和突起，细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。 结论：骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型．可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论.目的:体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能.方法:采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定.结果与结论:经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征.提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化.     

骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞Transwell共培养诱导形成软骨

背景:研究证实,关节软骨细胞具有分泌诱导因子促进骨髓间充质干细胞向关节软骨细胞分化的能力,但至今未见两种细胞运用Transwell共培养诱导骨髓间充质干细胞形成软骨的报道.目的:观察在Transwell共培养系统中共培养后,关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力.方法:骨髓间充质干细胞来源于4周龄SD大鼠的股骨及胫骨干骨髓,关节软骨细胞来源于4周龄SD大鼠的正常股骨头表面的关节软骨.分别吸取第3代骨髓间充质干细胞和关节软骨细胞,按1:1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入骨髓间充质干细胞,上室植入关节软骨细胞.同时设置相同浓度单纯骨髓间充质干细胞对照组,分别在含胎牛血清的DMEM培养基中培养,相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并对各组细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色及氨基聚糖含量检测.结果与结论:共培养组骨髓间充质干细胞数量增多,细胞外基质合成丰富,其基质能被Ⅱ型胶原免疫组化染色,细胞染色呈现黄色.氨基聚糖含量随着诱导时间增加而增多.提示关节软骨细胞分泌物具有促进骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力,与此同时,骨髓间充质干细胞还能分泌促进组织细胞修复的细胞因子,使共培养中的软骨细胞功能得以加强.由此可见,软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养诱导具有独特的优势.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件

目的:分析人骨髓间充质干细胞分离、纯化、体外扩增及其向软骨细胞分化的条件,为人骨髓间充质干细胞用于修复损伤的软骨组织提供依据。方法:实验于2005-03/2006-04在南昌大学医学院生化与分子生物学教研室完成。实验材料:无菌条件下采集无血液系统疾病和家族遗传史的28～65岁成人骨髓8份,进行骨髓间充质干细胞分离与培养,骨髓采集经患者及医院同意,并签署知情同意书。实验方法:取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞,实验组使用特定的、内含2mg/L胰岛素、3mg/L转铁蛋白、1mmol/L丙酮酸、100nmol/L地塞米松和10μg/L转化生长因子β1的低糖DMEM培养基诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,对照组细胞以低糖DMEM基础培养液培养。倒置显微镜下观察细胞形态,诱导7,14d采用半定量RT-PCR方法检测细胞软骨特异性Ⅱ型胶原表达,蕃红花O-亮绿染色分析蛋白多糖粘多糖含量,观察细胞分化情况。结果:①光镜观察成人骨髓间充质干细胞的形态变化:培养7d细胞集落明显,集落中央为数个至数十个圆形细胞,周围变形细胞围绕中央细胞呈放射状生长。培养14d细胞呈平行状或旋涡状排布,细胞排列紧密。②骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化:实验组细胞生长较对照组慢,培养7d后细胞大多呈椭圆形或三角形,部分细胞伸出似触角突起,培养14d细胞变形较明显,排列较为紧密,细胞突起多见,突起间相连,呈较明显软骨细胞形态特征。③骨髓间充质干细胞的番红花-O染色:实验组骨髓间充质干细胞蕃红花O-亮绿呈深染色,对照组人骨髓间充质干细胞呈阴性染色。④RT-PCR检测软骨特异性的Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达:实验组诱导培养7,14d人骨髓间充质干细胞有Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达,400～500bp条带间可见明显的荧光条带,诱导培养14d时表达更明显。对照组未见Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达。结论:采用直接贴壁培养法成功分离和培养出人骨髓间充质干细胞,并将人骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞,该软骨细胞具有软骨细胞的形态、生化特征。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响

目的：观察在成软骨诱导培养条件下，细胞传代对骨髓问充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响。方法：不同代MSCs成软骨诱导后，观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、RT-PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况。结果：经成软骨诱导后，第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高。结论：MSCs很可能由多种形态功能接近，分化潜能有略有差异的细胞组成；在成软骨诱导培养条件下，对此传代后成软骨能力减弱。     

体外团状培养系统中Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望,最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞是修复全层软骨缺损的最佳细胞源.目的:在体外团状培养系统中,以Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的重复观察测量实验,于2007-06/2008-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.材料:2月龄日本大耳白兔由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后,在团状培养系统中培养.通过组织学、免疫组化及反转录-聚合酶链反应方法检测其成软骨分化.主要观察指标:组织学染色观察细胞形态改变,免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:组织学染色显示,诱导后细胞呈软骨细胞样形态.免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应结果显示,诱导后的细胞表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原.结论:骨髓间充质干细胞经Ad-hTGF-β1诱导后在团状培养系统中可分化为软骨细胞.     

应用组织工程化肌腱修复跟腱缺损

背景:间质干细胞或间质祖细胞的非造血细胞可在体内或体外分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪及骨髓基质,这使得它们成为组织工程领域内非常有价值的种子细胞来源.目的:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建组织工程化肌腱,观察其修复跟腱缺损的效果.设计,时间及地点:随机对照动物实验,于2003年在中南大学湘雅医学院进行.材料:1.5～2.5 kg健康成年家兔由中南大学湘雅医学院动物学部提供,雌雄不限.聚羟基乙酸由威高集团康利达医用制品有限公司提供.SD大鼠由中南大学实验动物学部提供.方法:提取家兔骨髓,通过离心和贴壁法培养获取骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞进行分离、扩增.抽取SD大鼠尾腱,制备鼠尾Ⅰ型胶原溶液,并与聚羟基乙酸缝线混合培养构建胶原-聚羟基乙酸支架.将未经体外诱导的骨髓间充质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸支架中构建组织工程化兔肌腱模型,以不加入细胞的为对照.切开30只家兔踝部皮肤,分离出兔跟腱,造成3cm长缺损,实验组15只以自体骨髓间充质干细胞预制的组织工程化肌腱移植于缺损处,对照组15只以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架修复跟腱缺损.主要观察指标:组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损的效果.结果:含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原一聚羟基乙酸支架及不含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架回植于体内时大体观察呈条形凝胶状.回植于体内4周后实验组和对照组均可见移植处形成条索状组织,聚羟基乙酸缝线已降解.8周时观察可见实验组组织工程化肌腱与受体肌腱组织完好连接,呈条索状.与周围其他组织无粘连,为白色、有光泽的致密腱样组织,对照组所形成的组织较实验组细小、与周围组织有粘连.结论:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建的组织工程化肌腱可明显促进肌腱损伤的修复.     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法＋贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素

背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素。设计:随机对照实验。单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室。材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia)。方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成。①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基 50g/L胎牛血清 10g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同)。细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养。②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率。③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录。④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测。主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态。②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率。结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本。由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析。①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞。原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4d,传代后7～8d即可达到融合。②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致。③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P<0.01)。结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增。     

密度梯度离心结合贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:研究骨髓间充质干细胞的培养方法,以获取大量高纯度的骨髓间充质干细胞,对应用组织工程技术重建眼部组织治疗眼部疾病具有重要意义。目的:应用密度梯度离心结合贴壁法进行成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养,观察其生长特性及大量繁殖的可能性。设计:完全随机分组设计/重复测量实验。单位:中山大学中山眼科中心病理科实验室。材料:选用6周龄SD大鼠4只,雌雄不限,清洁级2级,体质量约250g/只,由中山大学动物中心提供,许可证号码SCSK(粤2004/0011)。DMEM/F12培养基(美国GIBCo公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)、胰蛋白酶、依地酸二钠、淋巴细胞分离液。纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31单克隆抗体,免疫组化二步法试剂盒(北京中杉生物技术公司)。方法:实验于2005-09/2006-01在中山大学中山眼科中心病理科实验室完成。①取SD大鼠,断颈处死后于750g/L酒精浸泡10min。无菌条件下,分离并暴露骨髓腔,用注射器吸入应用液直接插入股骨腔,用含肝素的培养液将骨髓腔里的细胞冲洗出来作为细胞混悬液,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察活体细胞生长情况。②将第2代细胞接种于预置在培养板内的无菌盖玻片上,当细胞基本融合时,取出作原位甲醇固定10min,苏木精-伊红染色。原位丙酮固定10min,按二步法作免疫组织化学纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31反应,3,3’-二氨基联苯胺显色,最后将盖玻片反扣在载玻片上,封固、观察。③将细胞按4.25×107L-1的浓度接种于96孔板中,每孔200μL,置培养箱中,分别于接种后1,2,3,4,5,6d各于两排孔中加入20μL/孔四甲基偶氮唑盐,继续培养4h后吸去上清液,每孔加200μL二甲基亚砜,振荡5min后,于570nm波长测吸光度值,绘制细胞生长曲线。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞活体培养观察结果。②2代细胞免疫组织化学染色观察结果。③接种后1,2,3,4,5,6d细胞生长曲线。结果:①刚接种入培养板的大鼠骨髓间充质干细胞于倒置显微镜下可见呈大小较一致的圆形,胞膜清晰,胞体透亮。第2天可见细胞已开始贴壁,3d后多数细胞伸出伪足,变成多角形、星形或不规则形。4d后细胞开始分裂繁殖,约12d细胞便基本单层融合,呈漩涡状排列。②对分离后所获得的细胞进行免疫组化染色,细胞CD44、纤维连接蛋白均阳性,CD34、CD31均阴性。③大鼠骨髓干细胞传代后第2天细胞数量就开始大量增加,至第5天数量达到顶点,细胞融合,生长达到平台期。结论:采用密度梯度离心结合贴壁培养法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,是实用、便捷和可行的方法。并且在体外培养条件下能大量增殖,为应用组织工程技术治疗眼部疾病提供种子细胞。     

不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞三维培养下成软骨能力的影响

背景:软骨组织工程要求植入的软骨细胞在三维支架材料中能够合成与软骨相同的软骨基质,而植入密度是成功的关键点之一.目的:探讨壳聚糖一胶原一硫酸软骨素支架上不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨能力的影响.设计、时间及地点:细胞一支架学体外观察,于2007-11/2008-07在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠6只,由中国医科大学实验动物中心提供.方法:室温下以乙酸为溶剂的5 g/L Ⅰ型胶原溶液与20 g/L壳聚糖按7:3体积比置于预冷的模具中混合,冷冻干燥后将支架切成5 mm×5 mm×2 mm,浸入含20 g/L硫酸软骨素的乙醇中室温交联,双蒸水冲洗至中性,再次冷冻干燥即为壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架.切取大鼠腹股沟脂肪组织,通过胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪间充质干细胞.将制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架分为3组,分别调整第3代细胞密度为2×109L-1,2×1010L-1,2×1011L-1,吸取细胞悬液50 μL均匀的种植于每个支架上,加入成软骨诱导培养基培养3周.主要观察指标:取样制成切片进行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,RT-PCR检测软骨特异性基因的表达.结果:诱导培养3周后,各组细胞在支架中生长黏附良好,且高种植密度2×1011L-1组细胞排列紧密.有较多的基质形成,并有软骨陷窝样结构:各组Ⅱ型胶原均呈阳性表达,并随细胞种植密度的升高呈递增趋势.RT-PCR结果显示.随着细胞种植密度的升高,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达逐渐增强,而Ⅹ型胶原mRNA的表达逐渐下降.结论:壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,2×1011L-1高密度种植有利于脂肪间充质干细胞的成软骨分化.     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。