先天性凝血因子Ⅴ缺乏症的一种新基因突变的鉴定

目的 探讨先天性凝血因子Ⅴ（FⅤ）缺乏症的分子发病机制。方法 利用发色底物法检测血浆FⅤ凝血活性，采用PCR产物直接测序或T－A克隆后测序，限制性酶切分析先证FⅤ基因，并进行家系和FⅤ基因多态性频率研究。结果 先证18号外显子存在G5729T（M16967）的纯合子突变，相应的氨基酸变异为Gly1880Val,FⅤ分子结构分析表明，突变后FⅤ的重链和轻链结合松弛。结论 FⅤ基因G5729T突变与先天性FⅤ缺乏症的发病有关。     

一种新的突变引起遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症

目的 研究一个遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺乏症家系的基因缺陷。方法 采用比浊法测定凝血酶原时间、凝血酶时间、活化的部分凝血活酶时间；采用凝血因子活性测定法(一步法)和BAELISA法对先证及其家系成员血浆FⅤ活性和抗原进行测定；采用PCR及DNA序列测定技术，对FⅤ基因组DNA中25个外显子和5′非翻译端的序列进行了：PCR扩增，PCR产物回收纯化后直接测序，并经T／A克隆测序对所发现突变进行证实。结果 先证血浆FⅤ严重缺乏，FⅤ活性为1％，FⅤ抗原为1．54％。基因研究显示为复合杂合子，其基因组DNA第4外显子675位核苷酸发生单个碱基A缺失，呈杂合状态，该致病基因来自先证母亲，与来自父方的另外一条等位基因的未知缺陷，共同导致先证血浆FⅤ严重缺乏。结论发现一种新的突变675delA，该缺失引起移码，导致转录提前终止，引起遗传性FⅤ缺乏症。     

一例遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症发病机制研究

目的研究遗传性凝血因子Ⅴ(FⅤ)缺乏症的发病机制.方法通过免疫学方法和发色底物法检测血浆和血小板中的FⅤ含量,采用PCR产物直接测序和限制性酶切分析FⅤ基因,应用分子模建对所鉴定突变的生物结构病理学进行研究.结果先证者血浆和血小板中FⅤ均缺乏.先证者FⅤ基因第1?763位核苷酸存在A→C突变(1?763A→C,EMBL AJ297254).模建分析表明,该突变将导致分子内部形成空洞,并可能破坏Tyr530与Glu330之间形成的氢键.结论 1?763A→C 突变将导致FⅤ稳定性降低,是致病的重要原因.     

1例凝血因子Ⅺ缺乏症的基因突变研究

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ促凝活性(FⅨ∶C)、FⅪ促凝活性(FⅪ∶C)及凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ∶C);采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物直接测序的方法对患者FⅪ基因进行直接检测,鉴别其中可能存在的基因变异。结果患者血浆中APTT、PT、TT、Fbg含量、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C及FⅫ:C分别为64.2s、12.8s、17.9s、3.8g/L、87.4%、71.2%、16.6%及80.2%,其FⅪ基因第13号外显子编码482位氨基酸的碱基发生杂合性的错义突变TGC→TGG(Cys482Trp)。结论 Cys482Trp的杂合突变可能是导致患者FⅪ缺乏的分子发病机制。     

遗传性凝血因子ⅩⅢ缺乏症两种新基因突变的确定

目的　探讨遗传性凝血因子 (F )缺乏症的基因缺陷。方法　采用PCR、核苷酸测序的方法对两个遗传性F缺乏症家系先证者及其亲属外周血白细胞基因组DNA的FA基因进行检测 ,并用RT PCR检测先证者外周血白细胞FA基因mRNA水平 ;ARMS PCR对 6 0名正常人外周血白细胞基因组DNA的FA基因进行检测。结果　①发现两种新的基因突变 ,先证者 1在第 12 41位核苷酸由C突变为G ,位于外显子 10 ,导致Ser413Trp(TCGTGG) ,先证者 2及其妹妹在第 2 32位核苷酸由C突变为T ,位于外显子 3,导致Arg77Cys(CGCTGC) ,均为单碱基突变 ,无限制性内切酶酶切位点的改变 ;先证者 1的父母及先证者 2的父、母、舅则分别在DNA水平相同位点呈杂合状态。②采用ARMS PCR法分析正常人群未发现这两种突变的存在。③患者血浆存在少量FA ,而FA基因在mRNA水平几乎没有变化。结论　这两例F缺乏症患者均由于FA基因缺陷造成。患者的FA在细胞内不稳定、易降解可能是F缺乏的原因。家系 1的突变位点在F的核心区 ,对其结构功能的影响较为明显。而家系 2的突变位点位于F的表面 ,可能对蛋白的空间结构产生影响。     

遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症三例

遗传性因子Ⅴ缺乏症由Owren于1947年率先报道,发病率约1/100万,是一种极少见的常染色体隐性遗传性疾病,我们收治了3例患者,现报道如下.     

遗传性因子Ⅴ缺乏症的基因研究

研究了一个遗传性凝血因子V（FV）缺乏症重型患者的基因缺陷，方法：采用RT－CPR及PCR技术，对先证者FV cDNA序列全长和基因组DNA中第11和第13外显子的序列进行了PCR扩增，PCR产物回收纯化后直接测序，结果：对先证者FV基因组DNA的部分序列的PCR扩增，经DNA测序，发现有两个基因突变位点，其中2863G→A为中性多态性位点，另一个3366C→G为突变，对先证者FV cDNA序列全长进行分段扩增均未见目的条带，结论：推测先证者FV缺乏可能为FV基因某种新的突变导致mRNA不稳定或转录调控异常所致。     

两个遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分子缺陷的初步探讨

目的：探讨两个遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症家系的基因突变类型。方法：用DNA直接测序法对2例患者及其家庭成员FⅦ基因进行分析；应用等位基因特异PCR（ASPCR）以及PCR辅助酶切反应鉴定是否有基因改变。结果：家系A中先证者有两种基因突变：6390位T→G导致Trp40Cys,11496位G→A导致Arg353Gln，这两个突变均为杂合子；PCR辅助MspⅠ酶切证实其母亲也是杂合子Arg353Gln。家系B的先证者有11482T→G，导致His348Gln,PCR辅助NspⅠ酶切证实称证者及其女含有同样的杂保子基因突变，不安现有11514位C→T导致Thr359Met,ASPCR证实先证者及其子携带同样的杂合子突变基因。结论：在两个遗传性FⅦ缺乏症家系中找到3种FⅦ基因的错义突变，其中Trp40Cys为首次报道。     

凝血因子Ⅴ抑制物致多项凝血因子活性假性降低

目的分析获得性凝血因子Ⅴ缺乏症患者多项凝血因子活性假性降低的原因。方法 4例患者凝血酶原时间(PT)及活化部分凝血活酶时间(APTT)均延长,对其进行纠正试验、狼疮抗凝物及凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性检测,并对活性降低的凝血因子稀释不同倍数后复检,对稀释后活性没有明显变化的凝血因子进行相应的抑制物筛查。结果 4例患者均出现多项凝血因子降低,纠正试验提示不纠正,狼疮抗凝物检测提示超出检测限,经不同稀释倍数稀释后,除凝血因子Ⅴ外,其他凝血因子活性水平大幅升高,凝血因子Ⅴ抑制物检测阳性。结论获得性凝血因子V缺乏症患者常伴有多种凝血因子活性假性降低,凝血因子Ⅴ抑制物的存在会干扰狼疮抗凝物的检测。     

遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症研究进展

凝血因子Ⅴ是凝血过程中重要的辅因子。除了凝血功能,FⅤ也通过辅助活化蛋白C下调活化因子Ⅷ间接参与生理性抗凝旁路途径。FⅤ的这一双重作用,使得FⅤ基因缺陷可能导致出血或血栓,形成两种完全相反的表型。本文着重就FⅤ引起遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症的分子发病机制及其与临床表型的关系作一综述。     

先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的分子发病机制

先天性凝血因子Ⅴ缺陷症是一种少见的常染色体隐性遗传性出血性疾病,其出血症状的异质性较大,人们对其分子发病机制知之甚少.近年来随着FⅤ基因的破析,使人们有可能在分子水平对先天性Ⅴ因子缺乏症进行研究,并发现了多种FⅤ基因的突变形式.这将有利于阐明先天性因子Ⅴ缺陷症临床表现的差异并最终治愈这一疾病.     

人类凝血因子Ⅻ基因一种新突变的发现与确证

目的 对一例凝血因子Ⅻ缺陷症患者进行凝血因子Ⅻ（Factor Ⅻ,F Ⅻ）基因序列分析,以发现可能存在的基因变异.方法 PCR结合直接测序方法对该患者F Ⅻ基因全部14个外显子及其侧翼序列进行分析,应用PCR产物反向测序法或等位基因特异PCR技术对突变位点进行确证,随机选择100名体检健康人作为正常对照.结果 该患者F Ⅻ基因第14外显子存在G1706A错义突变,5′非翻译区的46位核苷酸为TT纯合子;等位基因特异PCR证实在100名体检健康人中未发现F Ⅻ G1706A突变.结论 F Ⅻ基因的G1706A错义突变及5′非翻译区的46TT多态性可能与本例患者F Ⅻ缺陷有关.     

凝血因子Ⅶ基因突变的检测

目的 为检测福建省福州市一个遗传性凝血因子Ⅵ缺乏症先证者的因子Ⅶ基因突变类型。方法 采用PCR结合限制性内切酶HgiCI，以先证者及其母亲的FVⅡ基因片进行分析。结果 表明先证者的FVⅡ基因为C329G纯合子，其母亲为杂合子。结论 该家系为FVⅡ基因存在C329G突变的第2个遗传性因子Ⅶ缺乏症家系。     

74例血友病B患者FⅨ基因突变研究

目的 研究导致中国人血友病B的凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变类型的分布,并比较与美国白种人群有何异同。方法 从患者外周血白细胞抽提基因组DNA,分9段扩增Ⅸ基因外显子序列,用基因扩增转录测序技术直接测序法检出突变。结果 74例患者中有69例查到了FⅨ基因58种突变。分析比较这69例患者FⅨ基因突变类型的分布特征与美国白种人无显著性。中国不同地区之间差异也无显著性。结论 中国人血友病B的FⅨ基因突变类型非常分散,呈高度异质性。与美国白种人之间相比差异无显著性。     

两种凝血因子Ⅹ新基因突变的异位转录和体外表达研究

目的探讨遗传性凝血因子X（FX）缺陷症的分子发病机制。方法对在一个遗传性凝血因子X（FX）缺陷症家系中发现的两种FX基因新突变剪接位点突变IVS1＋1G〉A和错义突变Arg347His，分别进行异位转录和体外表达的研究，通过逆转录反应结合巢式PCR扩增的方法，检测患者外周血中的FX异位转录产物。针对Arg347His突变，将野生型FXcDNA克隆至真核细胞表达载体，定点突变构建Arg347His突变质粒。然后将野生型质粒和突变体质粒分别转染HEK293细胞，采用一期法检测细胞培养液中的FX活性；采用ELISA检测分别细胞裂解液和细胞培养液中的FX抗原含量。结果对于IVS1＋1G〉A突变，逆转录结合巢式PCR的产物经克隆后测序只检测到了正常的转录本，而没有发现异常转录本，原因可能是由于IVS1＋1G〉A导致了终止密码的提前出现，从而致使异常转录的mRNA在体内很快被降解。对于Arg347His错义突变，真核细胞表达结果发现，Arg347His突变并没有影响FX蛋白的合成分泌，但突变质粒转染的细胞所分泌的FX蛋白促凝活性明显下降。结论异位转录和体外表达的实验进一步证实了IVS1＋1G〉A和Arg347His是导致本家系先证者表现为FX缺陷症的原因。IVS1＋1G〉A突变导致了异常转录的mRNA在体内被很快降解；Arg347His突变显著降低了FX的促凝活性。     

一例FⅤ Leiden基因突变所致的抗活化的蛋白C现象

了解抗活性化的蛋白Ｃ在我国人群和血栓性疾患患者中发生情况。方法：用活化的蛋白－ＡＰＴＴ，我聚酶链反应及限制性内切酶分析，ＰＣＲ－ＳＳＰ及ＤＮＡ序列分析，对２８例正常人及１８例血栓性疾患患者进行ＡＰＣ测定及ＦⅤＬｅｉｄｅｎ突变杂合子；３例血栓性疾患患者ＡＰＣ－ＳＲ低于正常，但均无ＦⅤＬｅｉｄｅｎ突变。     

温度和时间对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性的影响

目的探讨温度、时间对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性的影响。方法对同份血浆留多个样本,每种标本留2份(其中1份离心处理),分别置于4℃24 h、72 h,室温24 h,测其Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性。结果①Ⅴ、Ⅷ凝血因子标本在4℃、室温放置24h、4℃放置72 h,标本间离心前与离心后,其活性Ⅷ因子平均下降1.1%(IU/m l),Ⅴ因子平均下降1.9%。②Ⅷ因子4℃24 h后与新鲜相比活性下降7.8%,72 h后下降11.2%,Ⅴ因子24 h后下降了3.3%,72 h后下降18.2%。③置4℃24 h与72 h,Ⅷ因子平均下降3.4%,Ⅴ因子下降14.8%。④4℃与室温24 h比较,Ⅷ因子活性平均下降了0.73%,Ⅴ因子活性平均下降了1%。⑤血型之间差异,4℃24 h后Ⅷ和Ⅴ因子活性分别为:A型下降了8%和2%,B型下降了8%和5%,O型下降了7%和3%,AB型下降了8%和3%;4℃72 h后Ⅷ和Ⅴ因子活性分别为:A型下降10.5%和19.5%,B型下降11%和20.1%,O型下降11.3%和20.3%,AB型下降12%和11.8%。结论①血浆在4℃放置24 h与在室温放置24 h相比较,对Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性影响差异很小。②4℃和室温下,同份标本在放置同样的时间离心前后Ⅴ、Ⅷ凝血因子活性下降很小。③Ⅷ因子活性在标本置24 h检测时下降相对较大,Ⅴ因子活性在72 h检测时下降相对较大。④Ⅷ因子活性在4℃24 h和72 h后下降程度,ABO血型间相差很小;Ⅴ因子活性在4℃24 h后下降程度,ABO血型间相差相对较大,72 h后A、B、O下降在20%左右,而AB型下降相对较少,为12%左右。