聚乙二醇化海葵神经毒素的稳定性考察

目的 考察聚乙二醇(PEG)修饰海葵神经毒素(rhk2a)所得产物mPEG-rhk2a的稳定性.方法 制备和纯化PEG化的修饰产物mPEG-rhk2a,并采用RP-HPLC法分别考察rhk2a和mPEG-rhk2a在4、25、37℃条件下的稳定性.结果 在4℃下,mPEG-rhk2a和rhk2a在放置24 d后,含量分...     

聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化和制备

目的建立聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化方法.方法运用Superdex75Highload制备型凝胶色谱柱,以含0.15mol/LNaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,流速为1.5ml/min,检测波长为215nm.结果各洗脱组分经SDS-PAGE检测呈单一条带.聚乙二醇修饰干扰素α2b的蛋白回收率为36.5%,抗病毒活性回收率为4.3%,比活度为4.74×10\\+7IU/mg,是原形干扰素α2b的10.4%.结论这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素α2b.     

非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白的分离纯化

目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,优化Hap。蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在280nm波长处的光吸收值（D280）,用折线图显示,SDS-PAGE电泳检测分布图中处于峰值的样品,观察目的蛋白条带的出现。结果弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,缓冲液l洗脱液的D280分布为基线,缓冲液2洗脱液的D280分布折线图中有峰值出现,但峰有拖尾,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰主要为低分子量的蛋白条带;五种不同离子强度的缓冲液3洗脱液在100mmol／L NaCl离子强度时,D280的分布折线图显示有较高洗脱峰出现,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰有较明显的110000D的目的条带,其余离子强度下均未见明显洗脱峰出现。结论Sepharose CM FF层析柱分离纯化Haps蛋白质片段时,不同pH值的缓冲液对目的蛋白的洗脱没有明显影响,而主要影响杂蛋白的洗脱;100mmol／L NaCl离子强度的缓冲液3洗脱液获得较好的洗脱效果。     

重组人瘦素的分离纯化

目的：探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法。方法：采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfast flow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fast flow)在pH7．5的条件下进行纯化。结果：经Q柱一步纯化后，产物纯度由42．3％到达89．6％，随后通过疏水层析纯化后，产物纯度达到96．2％。经SDS—PAGE证实为单一蛋白条带。结论：通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素。     

小牛胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化

目的：利用蛋白质分离化技术提取末端脱氧核苷酰转移酶（ＴｄＴ），以研究其分子组成、理化性质，探讨其与白血病之间的联系。方法：用匀浆、ＤＥＡＥ纤维互柱层析、磷酸纤维素柱层析、（ＮＨ４）２ＳＯ４分段盐析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ柱层析、羟灰石柱层析等方法，从小牛胸中分离纯化ＴｄＴ。每步均留样，测蛋白质含量和酶活力。结果：经一系列分离步骤，纯化ＴｄＴ，酶的活力增加２６．４倍，并发现在羟灰石柱层析的穿过部分，存在一     

阳离子交换树脂分离纯化钩藤总生物碱的工艺研究

目的 研究阳离子交换树脂分离纯化钩藤总生物碱的工艺条件。方法 分别以钩藤碱、钩藤总生物碱的比吸附量、洗脱率、产物质量分数为指标,优选钩藤总生物碱的最佳纯化工艺。结果 最佳工艺为钩藤药材提取液以6 BV/h的体积流量通过001×7氢型阳离子交换树脂柱（径高比为1∶8）,树脂饱和后,水洗至中性,再用含5%氯化钠的50%乙醇溶液以8 BV/h的体积流量洗脱,洗脱10倍量树脂柱体积。钩藤碱及钩藤总生物碱洗脱率分别为88.2%和89.9%,钩藤碱、钩藤总生物碱的质量分数分别为13.9%、47.6%。结论 采用001×7氢型阳离子交换树脂纯化钩藤总生物碱效率高,易实现管道化、连续化,具有广阔的工业应用前景。     

重组人睫状神经因子的表达、纯化以及聚乙二醇修饰

目的 研究重组人睫状神经因子(rh-CNTF)的表达、纯化及聚乙二醇化修饰、纯化方法.方法 重组人睫状神经因子(rh-CNTF)工程菌经37℃培养至对数生长期,加入IPTG诱导4 h,经Q Sepharose F.F凝胶柱纯化和复性后得到纯化的rh-CNTF.以体外培养鸡胚背根神经节(DRG)方法测定重组蛋白rh-CNTF的神经营养活性.用单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-ButyrALD-20 k)对rh-CNTF进行修饰,所得修饰产物经DEAE Sepharose F.F和Superdex 75凝胶分离纯化后获得mPEG-rh-CNTF偶联物.结果 目的 蛋白占总蛋白30%左右,为包涵体,经Q Sepharose F.F凝胶柱纯化和复性,获得纯度达90%的rh-CNTF.表达的rh-CNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长.修饰后的单聚PEG-rhCNTF经DEAE Sepharose F.F和Superdex 75凝胶纯化后纯度达到95%.结论 确立了rh-CNTF蛋白表达纯化及PEG修饰的方法.     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水层析,从重组大肠杆菌DH5a菌体中分离纯化得到粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA).经纯化,AfPGA纯度较粗酶提高50.6倍、比活达到212.7 U/mg,经HPLC测定纯度为92.8%,收率为78%.理化性质分析表明:AfPGA含有2个亚基(α亚基和β亚基,其Mw分别为2.90×104和5.92×104;AfP-GA等电点约为7.9～8.0,最适pH约为10.0,并在pH>7.0时表现出了稳定的催化活力.     

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的分离纯化细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)并加以鉴定,为进一步研制抗CK20单克隆抗体奠定基础。方法培养人膀胱肿瘤T-24细胞系并用免疫组化检测CK20表达,然后大量培养并收集细胞,超声波细胞粉碎后,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离,然后利用以DE52为介质的阴离子交换层析分离纯化CK20蛋白,以电泳示踪,最后采用SDS-PAGE、HLPC和Western-blotting加以鉴定。结果在阴离子交换层析时出现3组洗脱峰,CK20主要存在第二组峰中,该峰在SDS-PAGE和Western—blotting上均呈现单一条带,HLPC分析显示CK20蛋白主峰呈正态分布,仅处一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高,提取的蛋白可确认为CK20并且具有较高的免疫生物活性。     

NR4A1 DNA 结合域的表达纯化

目的：寻求一种核受体家族蛋白NR4A1 DNA结合域(NR4A1 DNA binding domain,NR4A1-DBD)表达纯化的 方法。方法：构建融合蛋白PET28a-NR4A1-DBD表达载体,分别通过镍亲和层析、阳离子交换层析及凝胶过滤的方法 对目的蛋白进行纯化。结果：PET28a-NR4A1-DBD蛋白在低温诱导(24 ℃)时多以可溶性形式存在,通过此纯化,可达 到每升培养基产生2~3 mg蛋白,纯度高达95%以上。结论：镍亲和层析是一种可靠、实用的蛋白表达纯化方法,后续 使用阳离子交换层析及凝胶过滤可以进一步提高蛋白纯度。     

麦胚凝集素的分离纯化及其在亲和层析中的应用

目的 :将分离纯化麦胚凝集素 (WGA)的方法和固定化WGA亲和层析柱的制备方法进行改良 ,从而得到能够有效结合细胞膜受体的亲和层析柱。方法 :依次用去脂抽提、分级盐析、离子交换层析、甲壳素亲和层析的方法分离纯化WGA ;将制备的WGA与用溴化氰活化的琼脂糖 4B(Sepharose 4B)耦联固定。结果 :得到的纯化倍数为 15 8 5倍的WGA单体相对分子质量为 160 0 0 ,表观相对分子质量为 3 2 0 0 0 ,血凝活力为 8 3mg·L-1。WGA Sepharose4B可以与红细胞表面糖基特异性结合。结论 :改良的WGA分离纯化方法和固定化WGA亲和层析柱的制备方法简便、有效 ,可用于实验室中细胞膜受体的研究     

大鼠精原细胞的分离纯化

目的：探讨大鼠精原细胞的分离纯化。方法：采用酶消化法制备10d Wister大鼠睾丸单细胞悬液；Percoll液不连续密度梯度分离精原细胞；用贴壁速度的差异纯化精原细胞。光电镜观察精原细胞的形态结构特征；应用酪氨酸蛋白激酶(c-kit)免疫化学鉴定精原细胞。结杲；精原细胞主要分布在28％～36％(Ⅱ带)间的Percoil梯度；分离纯化的精原细胞形态结构与组织切片上精原细胞一致，其纯度达55．68％；c-kit在精原细胞呈阳性表达，在睾丸体细胞呈弱阳性或阴性表达。结论：利用酶消化法、Percoll液不连续密度梯度及细胞贴壁速度的差异，分离纯化的精原细胞满足体外实验要求；精原细胞表达特异的c-kit受体。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

溶栓素的纯化研究

目的 :研究溶栓素的纯化工艺。方法 :采用超滤法截留分离 ,强阴离子交换层析去除核酸 ,弱阴/阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带 ,纯化倍数为 144 .83,回收率为 38.6 6 %。结论 :溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点 ,具有一定的实用性。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

NOD小鼠胰岛分离与纯化的方法研究

目的 :研究非肥胖性糖尿病 (NOD)小鼠胰岛分离与纯化的方法。方法 :采用改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化胰腺 ,分离成年NOD小鼠胰岛 ,不连续密度梯度Ficoll液 (2 5 % ,2 3% ,2 0 5 % ,11% )离心、纯化胰岛。用双硫棕 (Dithizone ,DTZ)对胰岛进行特异性染色 ,以葡萄糖刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果 :不同浓度 (0 5mg·ml-1,1mg·ml-1,2mg·ml-1)的胶原酶在不同时间 (2 0min ,4 0min ,6 0min)内静止消化胰腺后收获的胰岛数量和胰岛活性不同 ,采用 1mg·ml-1浓度的Ⅺ型胶原酶消化 4 0min后效果最好 ,平均能得到 (195± 8)个胰岛 /胰腺 ,活性 >90 % ,纯度 >90 %。DTZ染色后胰岛呈红色 ,形态完整。高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激后的 2倍。结论 :改良的胰导管逆行灌注胶原酶静止消化NOD鼠胰腺 ,及不连续密度梯度Ficoll液纯化胰岛的方法 ,可获得数量较多 ,纯度较高和功能较好的胰岛。     

新型重组海葵毒素hk2a对大鼠心室肌细胞离子通道的影响

目的观察新型基因重组海葵毒素rhk2a对大鼠心室肌细胞离子通道的影响。方法采用全细胞膜片钳技术分别记录rhk2a对大鼠心室肌细胞钠电流、L型钙电流和钠-钙交换电流的影响。结果与对照组相比,新型重组海葵毒素rhk2a能够明显减慢大鼠心室肌细胞钠通道的时间依赖性失活(τh)(14.15±4.6 ms vs2.03±0.30 ms, P<0.05),而rhk2a对大鼠心室肌细胞钙通道电流(-8.86±0.35 PA/PF vs-8.99±0.64 PA/PF,P>0.05)和钠-钙交换电流(-0.65±0.2 PA/PF vs-0.69±0.15 PA/PF, P>0.05)无明显直接作用。结论rhk2a对大鼠心室肌细胞钠通道的时间依赖性失活的减慢是rhk2a对心脏具有正性肌力效应的重要机制。     

板蓝根多糖分离纯化及其性质的研究

目的从板蓝根中提取分离水溶性多糖,并分析其理化性质,为板蓝根质量控制与进一步开发利用提供参考。方法主要采用DEAE纤维素离子交换色谱柱,Sephadex G 75凝胶色谱柱分离纯化,应用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、IR、TLC、UV等方法对板蓝根多糖进行组成结构分析及理化性质研究。结果从板蓝根水溶性多糖中分离纯化得到4种不同的均一多糖组分PS1、PS2、PS3、PS4,色谱分析表明均由单一木糖组成。其中PS1、PS2、PS3、PS4相对分子质量分别为1.2×104、2.6×104、4.2×103、2.5×103。结论4种均一多糖首次从板蓝根中分离得到。     

新生期小鼠胰岛分离纯化方法的研究

目的:探讨新生期小鼠胰岛分离纯化方案?方法:采用胰腺局部充盈?胶原酶Ⅴ消化,对比不同消化时间及单纯显微镜下手挑胰岛或Histopaque-1077纯化对胰岛得率的影响,并通过胰岛素/胰高血糖素双染后流式细胞术检测胰岛β和α细胞构成比例?结果:在1 mg/ml酶浓度下,1周和3周小鼠胰岛的最适消化时间分别为23 min(胰岛/胰腺38.11 ± 2.78)和25 min(胰岛/胰腺66.06 ± 2.61)?1周以直径< 50 μm胰岛居多(P < 0.01),而3周以50~99 μm者居多(P < 0.01)?单纯手挑组胰岛得率显著高于Histopaque-1077纯化组(P < 0.05)?所得胰岛存活率和纯度均> 90%,且存在β和α细胞构成比例的动态变化(P < 0.05)?结论:胰腺局部充盈?胶原酶Ⅴ消化后镜下手挑胰岛是一种较好的新生期小鼠胰岛分离纯化方法,消化时间和纯化方法是其重要影响因素?     

大鼠胰岛分离纯化和功能分析的研究

目的:探讨大鼠胰岛分离纯化的方案.方法:采用胰管内灌注胶原酶V消化、Histopaque-1077密度梯度离心分离纯化20只雄性SD大鼠胰岛.椎虫蓝染色判断胰岛存活率,双硫腙染色后计数胰岛,葡萄糖刺激胰岛素释放实验评估胰岛功能,同种异体胰岛门静脉移植治疗5只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,监测血糖变化.结果:分离纯化后平均胰岛得率为(646±67)个/大鼠,存活率达到90%以上.新鲜分离的胰岛呈椭圆或圆形,悬浮于培养液面,胞膜光滑完整,直径大于150μm的细胞团占95%以上.葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果表明:第1、3、5天胰岛的刺激指数分别为2.6倍、1.7倍和1.4倍,两组间低糖和高糖的胰岛分泌量差异均有显著性(P＜0.05).胰岛门静脉移植术后,第2天大鼠血糖降至11.1 mmol/L,8天内血糖可控制在15 mmol/L以下,随后血糖逐步升高.结论:采用胰管内灌注胶原酶V消化联合Histopaque-1077分离纯化是一种较好的大鼠胰岛分离方法,胰岛得率较高且功能良好.