重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验*

背景：以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势。 目的：观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓间充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性。 设计、时间及地点：随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成。 材料：新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0~3.0 kg。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103~1×1010 PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率。 主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFP BMSCs向神经样细胞的定向分化。 结果：3~6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性。当病毒滴度为1×107 PFU/mL时感染率为55%,1×109,1×1010 PFU/mL感染率均为85%,但1×1010 PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达最强,28 d仍可见荧光表达。感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性。 结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究绿色荧光蛋白基因（Ad—GFP）腺病毒载体在人骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响．探讨用该载体构建基因修饰BMSCs的可行性。方法在体外分离培养人BMSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型，293细胞包装制备病毒，以不同滴度的Ad—GFP（1×10^3-1×10^10PFU／mL）转染BMSCs．细胞计数法分析转染率．倒置显微镜观察细胞形态学改变．CCK8法检测细胞增殖活性，用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导转染Ad—GFP的BMSCs向神经元样细胞定向分化。结果3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45呈阴性而CD29、CD44呈阳性：当病毒滴度为1×10^7PFU／mL时转染率为55％，1×10^9及1×10^10PFU／mL滴度时转染率均为85％，但1×10^10PFU／mL滴度时出现细胞病理现象；7d荧光表达最强，28d仍可见荧光表达。荧光显微镜下可见表达Ad—GFP的BMSCs有三种亚群结构：滴度≥1×10^6PFU／mL时，BMSCs增殖在早期受到抑制，且呈剂量依赖；转染Ad—GFP的BMSCs经β一巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞，神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论合适滴度的Ad—GFP可以高效转染BMSCs，对细胞的生物学特性影响较小，不影响诱导分化功能，BMSCs可以作为用Ad—GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比*

背景：利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一。 目的：观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和rAAV2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增殖能力的变化。 方法：脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部。机械消化和酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增。分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达。rAAV2-EGFP转染后,需加入2 μL丁酸钠(1 mol/L)。采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。 结果与结论：体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。Ad5-EGFP组和rAAV2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%。腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高。腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景：增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。 目的：构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。 方法：用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。 结果与结论：从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6 000 bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。     

骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死的研究现状

背景：股骨头缺血性坏死发生在高承重区的髋关节,是一种特殊形式的无菌性骨坏死。骨髓间充质干细胞可能对坏死的股骨头具有很好的修复作用。 目的：了解骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头缺血性坏死的研究进展,为进一步研究打下基础。 方法：以Avascular necrosis of femur head,Femur head necrosis,Osteonecrosis,Bone marrow mesenchymal stem cells,Mesenchymal stem cells,Multipotent stem cells为检索词,检索Pubmed数据库(2000-01/2009-04);以股骨头缺血性坏死,骨髓间充质干细胞为检索词,检索CNKI数据库(1989-01/2009-04)。文献检索语种限制为英文和中文。纳入研究骨髓间充质干细胞的生物特性和功能、股骨头缺血性坏死的病因和病理、骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死的相关研究;排除重复文献。 结果与结论：计算机初检得到800余篇文献,根据纳入排除标准,对其中38篇文献进行分析。骨髓间充质干细胞在适当的培养条件下可以分化为软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞。随着干细胞工程的发展,骨髓间充质干细胞移植可能是一种修复骨坏死有效的治疗方法。文章叙述了股骨头缺血性坏死的病因、病理,分析了骨髓间质干细胞治疗股骨头缺血性坏死的理论依据,通过比较国内外骨髓间质干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死的动物实验研究和临床实验研究,来证实骨髓间充质干细胞治疗股骨头缺血性坏死的效果,希望以此找到更好的治疗方法。     

脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病30例

目的：观察脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病患者神经功能的效果。 方法：选择2008-01/12北京和众华信治疗中心收治的帕金森病患者30例,均经过英国皇家医师学会帕金森病诊断与管理指南的帕金森病诊断标准确诊,男19例,女11例,年龄45~66岁,平均年龄58岁,Hoehn-Yahr分级为Ⅱ~Ⅳ级,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准。所有患者均住院治疗,第1周进行常规检查,30例患者血、尿、便常规、肝肾功能、多项肿瘤标记物、胸片等均正常。自第2周起患者应用脐带血间充质干细胞进行鞘内注射移植治疗,以第3,4腰椎间隙为穿刺点,缓慢注入地塞米松2 mg,取脐血间充质干细胞注射液5 mL(干细胞数500万),在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔,1次/周,4次为1个疗程,共治疗1个疗程。采用帕金森病统一评分量表对患者移植前后神经功能进行评定,分值越高表示神经功能缺损越严重。 结果：30例患者均进入结果分析,中途无脱落。与移植前比较,30例患者移植后3个月帕金森病统一评分量表分值均明显降低(P < 0.01),患者震颤、强直、运动迟缓、姿势不稳等临床症状均得到明显改善,均未出现移植物抗宿主病。 结论：脐血间充质干细胞移植可以一定程度地改善帕金森病患者的临床症状,提高患者生活质量。     

肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗兔股骨头坏死

背景：课题利用实验室自主研制、已获国家SFDA批准临床试验的重组肝细胞生长因子腺病毒感染骨髓间充质干细胞,结合肝细胞生长因子的促血管新生和抗细胞凋亡以及间充质干细胞的成骨功能,通过细胞治疗的手段进行骨损伤修复。 目的：探讨肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对兔股骨头坏死骨缺损的治疗效果。 设计、时间及地点：细胞-材料学体内实验,于2007-09/12在北京放射与辐射医学研究所和解放军66400部队骨病专科医院完成。 材料：清洁级26~28周龄新西兰大白兔18只,由北京开源兔业养殖场提供。骨基质明胶为上海骁博科技发展有限公司产品。 方法：采用贴壁法分离培养兔自体骨髓间充质干细胞,体外鉴定成骨和成脂肪能力。18只兔均建立双侧股骨头坏死骨缺损模型,随机分为3组,6只/组,单纯材料组缺损区仅填塞骨基质明胶,细胞-材料组填塞复合骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,基因修饰细胞-材料组填塞复合Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞的骨基质明胶,各组细胞用量为 107个/缺损,骨基质明胶用量为27 mm3/缺损,修复3个月后取材进行组织学检查。骨髓间充质干细胞和Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞经荧光染料二醋酸琥珀酰酯羟基荧光素标记后,氯化钴处理72 h,流式细胞学分析细胞增殖情况。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的诱导分化,骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死的修复效果,Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞抗低氧损伤能力。 结果：培养的细胞在适当诱导条件下可分化为成骨和成脂肪细胞。修复后3个月组织学分析显示,单纯材料组仅见疏松的纤维肉芽组织填充;细胞-材料组可见致密的纤维肉芽组织填充,其间有较多的新生血管,但未见新生骨组织;基因修饰细胞-材料组多为软骨样组织填充,周围可见新骨带形成。各组Lane-Sandhu骨组织学评分比较差异有非常显著性意义(P < 0.01),其中基因修饰细胞-材料组评分最高,即Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具备最佳的骨修复能力。培养体系中加入氯化钴后,已增殖的Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞比例显著高于未感染骨髓间充质干细胞(P < 0.001)。 结论：在骨缺损模型中Ad-HGF感染的骨髓间充质干细胞具有更强的抗低氧损伤能力,其在体内成骨能力优于未感染的骨髓间充质干细胞,提示肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植是应用于缺血性骨坏死的有效治疗途径。     

经动脉骨髓间充质干细胞移植联合普伐他汀治疗早期股骨头缺血性坏死

背景：近年来干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死逐渐兴起,股骨头坏死的发病除与各种原因引起的局部组织缺血有关以外,研究还发现股骨头坏死的发病可能与成骨细胞及骨髓基质细胞的功能下降有关。 目的：观察经动脉自体骨髓间充质干细胞移植联合普伐他汀治疗Ⅰ~Ⅱ期股骨头缺血性坏死的可行性。 方法：纳入股骨头缺血性坏死患者32例49髋,经集落细胞刺激因子动员后采集患者骨髓间充质干细胞,采用Seldinger穿刺技术,从非治疗侧股动脉成功穿刺后,通过非治疗侧的髂总动脉、腹主动脉至治疗侧髂总动脉,注射非离子对比剂15 mL。将自体干细胞悬液通过导管分2次缓慢注射入旋股内、外侧动脉及闭孔动脉,每次注射时间大于5 min。干细胞移植治疗术毕,口服普伐他汀联合治疗。治疗后随访,观察股骨头缺血性坏死临床症状改变情况和髋关节活动度。 结果与结论：32例患者49髋均完成半年以上随访,患者髋部疼痛缓解,髋关节功能改善,关节活动范围明显扩大,尤其是外展功能恢复明显行走距离增加。16例21髋患者治疗6个月后股骨头血管造影结果显示,股骨头内新生血管增多,血供改善。提示骨髓间充质干细胞移植联合普伐他汀治疗早期股骨头缺血性坏死损伤小,可有效恢复髋关节功能,阻止或延缓疾病的进一步发展。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞***☆

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的作用与机制

背景：骨髓间充质干细胞具有强大的自我增殖能力和分化多潜能性,是治疗早期股骨头坏死的热点。目的：总结骨髓间充质干细胞的生物学特性及其治疗早期股骨头坏死的方法与机制。方法：由第一作者检索PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)1992-01/2010-10及清华同方中文系列数据库(http://www.cnki.net/index.htm)2000-01/2010-10涉及骨髓间充质干细胞的生物学特性及其治疗早期股骨头坏死内容的文献,英文关键词为“femur head necrosis,mesenchymal stem cell,cell culture,therapy,overview”,中文关键词为“股骨头坏死,骨髓间充质干细胞,细胞培养,治疗,综述”,排除陈旧性、重复性文献,保留30篇文献归纳总结。结果与结论：利用骨髓间充质干细胞显著的成骨及成血管作用,直接作用于股骨头坏死病灶部位,达到治愈早期股骨头坏死的目的,是目前治疗早期股骨头坏死的热点。今后应进一步分析移植后骨髓间充质干细胞在缺血坏死股骨头内增殖分化的潜能及影响因素、新生血管再狭窄的预防、骨缺损修复的时间,以及骨髓间充质干细胞移植至体内后影响干细胞存活和分化的因素,如局部感染、全身免疫情况等,介入治疗时干细胞是否会随着血流的冲击而流至其他部位,这些问题依然需要进一步解决。     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头缺血性坏死44例

股骨头缺血性坏死患者股骨头内间充质干细胞数量减少,成骨分化能力降低是不能实现有效自身修复的细胞病理原因,坏死区周围的硬化带阻碍了骨修复的实现。对于早期股骨头缺血性坏死,自体骨髓间充质干细胞移植结合髓芯减压改善坏死区的血运及促进骨修复的治疗结果分析尚缺乏系统报告。 目的：根据随访结果分析自体骨髓间充质干细胞移植结合髓芯减压治疗早期股骨头缺血性坏死的效果。 方法：2005-05/2008-09共治疗早期股骨头缺血性坏死患者44例,所有接受细胞移植股骨头坏死均为ARCO1或2期,共76髋。采用浓缩自体骨髓细胞悬液回注坏死股骨头内并结合髓芯减压,剩余骨髓血洗涤回输。其中ARCO1期患者仅行干细胞悬液注射,ARCO2期患者移植后行髓芯减压,以Harris评分评价髋关节功能状态。 结果与结论：至2009-03,共随访(22.3±4.2)个月。至随访终期,66髋较细胞移植前疼痛缓解或无明显进展,功能改善,占86.9%;10髋疼痛加重,ARCO分期进展至3或4期,其中3髋行人工关节置换。提示自体骨髓间充质干细胞移植结合髓芯减压是治疗早期股骨头缺血性坏死的有效方法,在早期股骨头缺血性坏死的各种治疗方法中,与其他减压及手术方法相比更符合针对病因的治疗,进一步扩大应用有可能获得更佳的临床效果。     

脐带间充质干细胞移植治疗初发1型糖尿病

背景：研究证实,新诊断的1型糖尿病患者,接受自体造血干细胞治疗后,绝大多数患者胰岛β细胞功能增强,不依赖胰岛素的时间也延长。 目的：观察人脐带间充质干细胞移植治疗初发1型糖尿病的临床疗效。 方法：选择12例病程<3个月的初发1型糖尿病患者,其中6例行人脐带间充质干细胞和胰岛素治疗,另外6例行单纯胰岛素治疗。移植前及移植9个月后分别监测空腹及餐后血糖、胰岛素用量、C肽、HbA1c的变化和记录不良反应。 结果与结论：随访9个月,干细胞治疗组的空腹血糖,糖化血红蛋白及C肽水平都有明显的改善,而对照组C肽水平明显下降,其他指标变化不明显。提示,人脐带间充质干细胞治疗初发1型糖尿病疗效良好。     

异种脐带间充质干细胞静脉应用的安全性

背景：人脐带间充质干细胞因其来源丰富,具有较强增殖分化能力,不涉及伦理道德问题,有望成为组织修复与再生工程的首选细胞。但是,对人脐带间充质干细胞异种静脉移植的安全性研究较少。 目的：观察Wistar大鼠静脉输注人脐带间充质干细胞后的安全性。 方法：SPF级Wistar大鼠30只,随机分为空白对照组、阴性对照组、细胞移植组,每组10只,雌雄各半。体外分离扩增人脐带间充质干细胞,细胞移植组大鼠尾静脉一次注射5×106间充质干细胞,注射体积为1 mL;阴性对照组大鼠尾静脉一次注射相同体积50 g/L葡萄糖注射液。注射后每天观察大鼠一般症状,14 d后解剖动物,进行血常规、血生化和脏器病理学检查及脏器质量测定。 结果与结论：细胞移植组大鼠血常规、血生化与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植组大鼠脏器组织病理学观察与对照组大鼠无明显光镜下形态学差别。结果提示Wistar大鼠一次性静脉移植人脐带间充质干细胞是安全可行的,人脐带间充质干细胞异种移植对受者无不良影响。     

异体脐带血干细胞治疗中枢性疼痛一例

目的探讨1例中枢性疼痛患者接受脐带血干细胞移植后症状转归。方法随访我院1例脑缺血缺氧后中枢性疼痛患者给予2次静脉、4次腰穿鞘内注射途径移植干细胞,每次移植间隔5天,治疗后随访患者疼痛变化情况2个月。结果从第2次脐带血干细胞移植开始,患者的疼痛情况及生活质量均有一定改善,移植结束后2个月患者疼痛又开始反复。结论脐带血干细胞移植可能为中枢性疼痛的治疗提供新的治疗途径。     

Rapsyn重组质粒转染小鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可能性,并观察Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达。方法采用全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL/6小鼠的BMSCs,在体外进行扩增、传代。取第3代细胞,采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至BMSCs中,并置荧光显微镜下观察转染结果;采用Western blot法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达。结果 BMSCs经转染后24h可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染pEGFP-N1/Rapsyn质粒的BMSCs可稳定表达Rapsyn蛋白。结论利用脂质体介导法可将Rapsyn基因转染至BMSCs中,并能稳定表达Rapsyn蛋白。