西妥昔单抗治疗鼻咽癌的研究进展

鼻咽癌表皮生长因子受体(EGFR)过表达与不良预后相关,西妥昔单抗竞争性阻断EGFR与配体结合,阻断酪氨酸激酶磷酸化及下游胞内信号通路活化,发挥抗肿瘤作用。西妥昔单抗联合放、化疗用于治疗局部晚期及复发转移性鼻咽癌,耐受性良好,近期疗效显著,不良反应可控。在现有研究证据上应设计有针对性的临床研究,以确定西妥昔单抗与放、化疗的合理联合模式,进一步提高鼻咽癌疗效。该文就西妥昔单抗的作用机制及其用于鼻咽癌治疗的研究现状和进展进行综述。     

舒尼替尼诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达NKG2DLs的机制

目的：初步探讨舒尼替尼诱导高、低表达ABCG2(ATPbinding cassette superfamily G member 2)分子的耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（简称ABCG2highCNE2/DDP细胞、ABCG2lowCNE2/DDP细胞）中NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）表达的分子机制。方法：Caspase8活化试剂盒和线粒体膜电位法分别检测NK细胞处理后ABCG2highCNE2/DDP细胞和ABCG2lowCNE2/DDP细胞caspase8活化水平和线粒体膜电位。RTPCR检测舒尼替尼处理前后两种CNE2/DDP细胞DNA损伤修复系统相关信号分子mRNA的表达。结果：CNE2/DDP细胞+NK细胞组中两种CNE2/DDP细胞caspase8活性均明显增强;舒尼替尼处理后的ABCG2low CNE2/DDP细胞+NK细胞组和ABCG2highCNE2/DDP细胞＋NK细胞组中caspase8的活性是处理前的2～2.5倍（P<0.01）。舒尼替尼预处理后,CNE2/DDP细胞和NK细胞共培养体系中两种CNE2/DDP细胞的线粒体膜电位分别为(76.58±2.32)%和(73.11±1.93)%,较舒尼替尼处理前明显降低（P<0.05）。舒尼替尼可上调两种CNE2/DDP细胞中ATR、CHK1和CHK2 mRNA的表达,并诱导P53和NFκB mRNA的表达。结论：舒尼替尼可能通过激活DNA损伤修复系统相关信号分子和NFκB的表达,诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,同时经由死亡受体信号通路和线粒体信号通路增强NK细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。     

鼻咽癌PTEN和survivin基因与西妥昔单抗耐药的相关性研究

目的 探讨鼻咽癌PTEN 和survivin 基因与西妥昔单抗耐药的相关性。方法 以人鼻咽癌细胞株5-8F 细胞为研究对象,采用逐步增加剂量法诱导建立西妥昔单抗耐药细胞5-SF/Erbitux; MTT法检测西妥昔单抗对细胞的半数抑制浓度IC50,计算耐药指数（RI);计数法描绘生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot 法检测细胞PTEN、survivin 的表达;实时荧光定量PCR (QPCR）检测细胞PTEN、survivin 基因的表达量;测序方法检测细胞PTEN 基因第5、7、8 外显子是否突变。结果 建立西妥昔单抗耐药的人鼻咽癌细胞系5-8F / Erbitux,西妥昔单抗作用3 天和5 天的RI 分别为1.2 和1.1 , 5-8F与5-8F/Erbitux 细胞的倍增时间分别为26.63h 和142.30h ; 5-8F Erbitux 的G0／Gl期比例显著增高（P<0. 001) , S 期比例显著下降（P＜0.001) , G2/M 期比例下降,但差异不显著（P＞0.05) ; 5-SF / Erbitux 细胞PTEN 蛋白表达水平显著升高（P<0.001) , survivin 蛋白表达水平显著下降（P＜0.001) ; Survivin 基因表达量显著下降（P＝0.000) , PTEN 基因表达量有所升高,但差异不显著（P＝0.085）。通过比对,5-SF/Erbitux 细胞PTEN 基因第5、7、8 外显子未见突变。结论 西妥昔单抗可通过增强PTEN 的表达和降低survivin 的表达抑制鼻咽癌细胞增殖。鼻咽癌PTEN 缺失或突变以及survivin 过表达与西妥昔单抗耐药无关。     

IL-2、IL-15增强免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞的杀伤活性

目的:观察IL-2、IL-15对免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性的影响.方法:抗CD56磁珠纯化NK细胞后分为4组:(1)编辑前NK细胞组:加入1130 U/ml IL-2;(2)单纯编辑组:NK细胞与CNE2细胞10:1混合,加入100U/ml IL-2;(3)IL-2再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入1 000 U/ml IL-2;(4)IL-15再培养组:纯化编辑后的NK细胞,加入10 ng/ml IL-15.24 h后,流式细胞仪检测各组NK细胞表面NKG2D的表达;LDH释放测定法测定效靶比20:1时各组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性.结果:编辑前NK细胞组、单纯编辑组、IL-2再培养组、IL-15再培养组NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(97.63±0.83)%、(53.50±1.25)%、(94.47±1.00)%、(98.07±0.21)%.IL-2、IL-15再培养组NK细胞NKG2D的表达分别比单纯编辑组有显著的增加(P＜0.01),该4组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.90±3.27)%、(4.70±2.30)%、(31.70±3.56)%、(40.18±2.94)%,IL-2再培养组、IL-15再培养组明显提高编辑后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性(P＜0.01),IL-15的作用强于IL-2.结论:高剂量IL-2、IL-15可以上调免疫编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,恢复编辑后NK细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性,IL-15的作用强于IL-2.     

调强放疗联合西妥昔单抗及顺铂治疗晚期鼻咽癌

摘 要 目的: EGFR与鼻咽癌关系密切，西妥昔单抗是一种特异性阻断EGFR的单克隆抗体。观察调强适型放射治疗联合西妥昔单抗(cetuximab)及顺铂（cisplatin ,又称DDP）方案治疗晚期鼻咽癌的有效性和安全性。方法: 2007年7月至2007年12月共8例入组，其中初治鼻咽癌7例，复发鼻咽癌1例，所有病例均为Ⅲ、Ⅳ期；所有患者都签署知情同意书，研究报伦理委员会批准。治疗方法包括调强放疗、顺铂、西妥昔单抗（400 mg/m2，放射治疗前1周；250 mg/m2，每周1次，放疗期间维持）。结果: 8例均完成调强放疗。8例完成西妥昔单抗治疗4～8疗程，平均6个疗程；3例因肝功异常未行同期化疗，3例完成DDP 30 mg/m2化疗4～7疗程，1例完成DDP 100 mg/m2化疗2疗程，1例完成DDP 100 mg/m2化疗1疗程。8例均出现皮肤痤疮样皮疹，主要急性毒性反应为黏膜炎和骨髓抑制；黏膜炎8例；白细胞下降3例；3个月后所有反应为0～1级。8例均达完全缓解(complete remission,CR)，1例患者综合治疗后3个月出现肋骨转移。结论: 调强放疗联合西妥昔单抗及顺铂方案治疗晚期鼻咽癌的不良反应主要为口咽黏膜炎和疼痛较重，有2例不可耐受，建议降低西妥昔单抗的剂量。近期疗效令人满意，远期疗效尚需观察。     

胰岛素样生长因子1受体信号通路与西妥昔单抗在鼻咽癌耐药机制中的关系

目的 建立西妥昔单抗耐药的人鼻咽癌细胞系5-8F/Erbitux,初步探讨胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)信号通路与西妥昔单抗在鼻咽癌耐药机制中的关系.方法 以表皮生长因子受体(EGFR)高表达且西妥昔单抗抑制率较高的人鼻咽癌5-8F细胞株为研究对象,采用逐步增加剂量法诱导建立西妥昔单抗耐药细胞5-8F/Erbitux.采用四甲基偶氮唑蓝(MTr)法检测西妥昔单抗对5-8F/Erbitux细胞的半数抑制浓度(IC50),计算耐药指数(RI).计数法描绘5-8F/Erbitux和5-8F细胞的生长曲线,计算倍增时间(TD).以流式细胞仪检测5-8F/Erbitux和5-8F细胞的细胞周期.采用MTT法检测5-8F/Erbitux细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(DDP)及紫杉醇(TAX)的交叉耐药谱.采用Western blot法检测5-8F/Erbitux和5-8F细胞中P糖蛋白(P-gp)、IGF-1R及磷酸化IGF-1R(p-IGF1R)的表达.采用实时荧光定量PCR法检测5-8F/Erbitux和5-8F细胞中多药耐药基因(MDR1)的表达量.结果 成功建立西妥昔单抗耐药的人鼻咽癌细胞系5-8F/Erbitux,西妥昔单抗作用3 d和5 d时的RI分别为1.2和1.1.5-8F和5-8F/Erbitux细胞的TD分别为26.63 h和142.30 h.与5-8F细胞比较,5-8F/Erbitux细胞中G0/G1期比例显著增高(P＜0.001),S期比例显著下降(P＜0.001).5-8F/Erbitux对5-Fu存在交叉耐药(RI=3.95,P＜0.01),对TAX和DDP不存在交叉耐药(RI分别为1.14和0.68,均P＞0.05).与5-8F细胞相比,5-8F/Erbitux细胞中P-gp、IGF-1R及p-IGF-1R蛋白的表达水平均显著升高(均P＜0.001).MDR1基因在5-8F细胞中未检测到,而在5-8F/Erbitux细胞中仅有很微量的表达.结论 西妥昔单抗耐药细胞5-8F/Erbitux不存在与传统化疗药物相似的多药耐药性;过度活化的IGF-1R信号通路可能是5-8F/Erbitux细胞耐药的机制之一.     

西妥昔单抗疗效预测指标的研究进展

西妥昔单抗(cetuximal)是一种抗表皮因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)人/鼠嵌合型IgG1单克隆抗体.能够阻碍内源EGFR配体的结合,进而阻断受体的二聚化、酪氨酸激酶磷酸化及其信号转导从而抑制受体的功能.此外,西妥昔单抗还可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cellular cytotoxicity;ADCC)靶向杀伤表达EGFR的肿瘤细胞.西妥昔单抗对许多种肿瘤均有效,并能够提高放化疗的敏感性.EGFR免疫组化阳性表达是最初进行西妥昔单抗治疗的患者入选标准,然而,部分患者并未从西妥昔单抗的治疗中获益.一些临床研究结果也证实EGFR免疫组化结果与EGFR单抗治疗疗效并不甚相关.因此这就需要进一步探讨西妥昔单抗治疗有效性的标记物.     

西妥昔单抗在鼻咽癌中的研究进展及临床应用

摘 要：鼻咽癌高发于东南亚及我国南方,顺铂为基础的同步放化综合治疗模式下,仍存在约30%的治疗失败,需要寻找新的药物靶点及治疗策略以进一步提高疗效。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在超过85%鼻咽癌中呈现高表达,且与不良预后、高转移和治疗抵抗等密切相关。因此,针对EGFR的分子靶向治疗可能进一步提高鼻咽癌的疗效。西妥昔单抗是EGFR的IgG1人鼠嵌合型单克隆抗体,临床研究中与放化疗联合治疗鼻咽癌取得了较好的疗效。体内外研究也表明,西妥昔单抗具有放化疗增敏作用,但具体分子机制仍在探索之中。与西妥昔单抗疗效预测相关的生物标志物也有待开发,以更好实现临床的个体化及精准治疗。文章就西妥昔单抗在鼻咽癌中的研究进展及临床应用作一综述。     

西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对肺癌细胞的抑制作用

目的：探讨西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对肺癌细胞的体外抑制作用.方法：体外诱导和扩增外周血淋巴细胞,流式细胞仪检测扩增后细胞表型.CCK-8法检测西妥昔单抗与NKTm细胞以不同时间点联合应用对A549细胞的抑制率,采用金氏公式计算增效Q值,评价合用的效应强度是否优于单用.结果：西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用组的抑制率高于两者单独应用组（P＜0.01）,联合应用具有协同效应（Q＞1.15）,西妥昔单抗应用后18小时再给予NK、T混合淋巴细胞组的Q值最高（Q=1.31）.结论：西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对A549细胞的抑制具有协同效应.     

西妥昔单抗联合放化疗治疗中晚期鼻咽癌的临床观察

目的　观察调强放疗（ＩＭＲＴ）联合西妥昔单抗（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ,Ｃ２２５）治疗鼻咽癌患者的近期疗效和毒副反应。方法　回顾性分析１０例中晚期鼻咽癌患者调强放疗联合Ｃ２２５治疗的临床资料,患者行鼻咽部病灶及颈淋巴结引流区的调强放疗,放疗同步加用Ｃ２２５每周１次静脉滴注,首剂４００ｍｇ／ｍ^２,以后每周２５０ｍｇ／ｍ^２,共８周。结果　１０例患者全部完成治疗,均评价为ＣＲ,有效率为１００％。主要毒副反应为痤疮样皮疹及口腔黏膜反应。结论　放化疗同步加用Ｃ２２５治疗鼻咽癌近期疗效好,其毒副反应患者尚可耐受,其远期疗效有待进一步观察。     

分子靶向药物诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达

目的：探讨不同分子靶向药物对高表达与低表达ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATPbinding cassette superfamily G member 2,ABCG2）的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞（分别简写为ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP）表面NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands, NKG2DLs）表达的诱导作用及其对NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：免疫磁珠法分选ABCG2 highCNE2/DDP、ABCG2lowCNE2/DDP细胞及NK细胞。流式细胞术检测分选细胞的纯度和不同分子靶向药物（硼替佐米、索拉非尼、舒尼替尼）处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达率。LDH释放法检测不同药物处理前后ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性。结果：ABCG2 highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞表面ABCG2的表达率分别为（91.40±2.32）%和（1.70±0.24）%。分选后NK细胞中CD3-CD16+CD56+细胞的比例达90%以上。药物处理前,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3呈弱表达;经不同分子靶向药物处理后,5种NKG2DLs的表达率均明显上升(P<001),以舒尼替尼处理后NKG2DLs的表达率升高最明显。随着NKG2DLs表达的上调,ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞对NK细胞杀伤的敏感性也随之升高。结论：不同分子靶向药物可诱导耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs的表达,以舒尼替尼的诱导作用最强,且肿瘤细胞NKG2DLs的表达与其对NK细胞杀伤敏感性之间存在线性关系。     

舒尼替尼体内诱导耐药鼻咽癌细胞表达NKG2DLs增强NK细胞的抑瘤作用

目的：探讨体内条件下舒尼替尼对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs（natural killer group 2 member D ligands)表达的诱导作用,及其对NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法：建立ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分如下8组：A、E组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,B、F组分别接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,C、G组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞;D、H组接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞。检测各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积和抑瘤率。免疫组织化学法检测移植瘤组织中NKG2DLs的表达。结果：A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤出现时间分别为(5.43±1.00)、(8.50±035)、(1110±1.25)、(13.56±1.23) d和 (9.00±1.00)、(12.30±0.78)、(14.50±0.50)、(17.25±0.77) d,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组（D 和H 组）成瘤时间最晚（P<0.01）。A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤质量分别为(2.63±089)、(1.00±003)、(065±0.08)、(0.21±0.27) g和(2.79±0.83)、(1.18±0.77)、(0.96±0.50)、(0.86±0.82) g,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组肿瘤质量最小（P<001）;舒尼替尼与NK细胞联合处理的D组和H组的抑瘤率分别为92%和69%。舒尼替尼上调移植瘤组织中NKG2DLs的表达,且ABCG2highCNE2/DDP细胞移植瘤中的NKG2DLs表达率高于ABCG2lowCNE2/DDP细胞。结论：舒尼替尼可在体内诱导CNE2/DDP移植瘤组织表达NKG2DLs,增强NK细胞的抗肿瘤作用。     

苹果酸舒尼替尼诱导高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2的耐药鼻咽癌细胞高表达NKG2D配体

目的:探讨苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate, SU11248)对高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP(ABCG2high CNE2/DDP)表达NKG2D配体的诱导作用.方法:利用免疫磁珠技术分离ABCG2highCNE2/DDP细胞及同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactive natural kill cell, Allo-NK),流式细胞技术检测分离后细胞的纯度及苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测苹果酸舒尼替尼处理前后ABCG2highCNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性.结果:ABCG2highCNE2/DDP细胞分离后ABCG2的表达率为(91.40±2.32)%,Allo-NK细胞分选后CD3-CD16 CD56 细胞的纯度达90%以上.经苹果酸舒尼替尼处理后,ABCG2highCNE2/DDP细胞的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达率由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(89.12±4.56)%、(66.10±2.22)%、(67.56±4.19)%、(69.37±8.83)%、(63.28±3.31)%.在效靶比为10∶1、20∶1时,苹果酸舒尼替尼处理前后Allo-NK细胞对ABCG2highCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(27.26±6.81) % 及(41.12±4.12)%、(57.25±2.37)%,处理后的杀伤率有明显的提高(F=15.58, P＝0.000).结论:苹果酸舒尼替尼通过诱导高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使ABCG2high CNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性明显增强.     

同种异体NK细胞对人多药耐药鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的: 研究同种异体自然杀伤（natural killer，NK）细胞对人多药耐药鼻咽癌细胞CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，探讨异体间的免疫治疗。方法：PCRSSP法分析CNE2/DDP细胞人白细胞抗原（human leucocyte antigen， HLA）基因型和健康人NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋     

5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对CNE2和CNE2/DDP细胞体外作用的观察

目的:观察5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力对CNE2和CNE2/DDP的生物作用。方法:荧光分光光度计检测PpⅨ荧光强度;MTT法测定细胞存活率。结果:两种细胞内PpⅨ荧光强度与孵育时间(CNE2:F=65.56,P=0.000;CNE2/DDP:F=28.07,P=0.000)和5-ALA浓度(CNE2:F=6292.36,P=0.000;CNE2/DDP:F=914.36,P=0.000)成正相关,在相同孵育时间(t=17.28,P=0.01)及5-ALA浓度(t=36.07,P=0.000)条件下,CNE2胞内PpⅨ荧光强度均显著高于CNE2/DDP。CNE2或CNE2/DDP细胞存活率与孵育时间(CNE2:F=2245.98,P=0.000;CNE2/DDP:F=236.92,P=0.000)、5-ALA浓度(CNE2:F=55.26,P=0.000;CNE2/DDP:F=10.68,P=0.000)和激光能量(CNE2:F=3294.21,P=0.000;CNE2/DDP:F=285.65,P=0.000)成负相关,相同孵育时间(t=31.35,P=0.000)、5-ALA浓度(t=37.16,P=0.001)及激光能量(t=12.84,P=0.001)条件下,CNE2细胞存活率显著高于CNE2/DDP。结论:5-ALA-PDT对CNE2和CNE2/DDP细胞均具有杀伤作用,但在相同条件下,5-ALA-PDT对CNE2的杀伤作用大于CNE2/DDP。     

NK细胞杀伤人骨髓瘤RPMI8226细胞的活性及其可能的机制

目的:研究同种异体NK细胞对人骨髓瘤RPMI 8226细胞的杀伤活性及其可能的机制。方法:LDH释放法检测NK细胞对RPMI 8226细胞和人白血病K562细胞的杀伤活性,流式细胞术和RT-PCR法分别检测K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达;阻断K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体的表达后,检测NK细胞的杀伤活性。结果:NK细胞对RPMI 8226靶细胞的杀伤活性明显低于对K562靶细胞的杀伤(P<0.01)。K562细胞高表达NKG2D配体,不表达HLA-Ⅰ类分子;RPMI 8226细胞低表达NKG2D配体,高表达HLA-Ⅰ类分子,其HLA基因型为A 01,66;B 58,58;Cw 03,06。阻断NKG2D配体后NK细胞杀伤K562细胞的活性明显降低(P<0.01),而杀伤RPMI 8226细胞的活性无明显改变;阻断HLA-Ⅰ类分子,NK细胞杀伤K562细胞的活性无变化,而杀伤RPMI 8226细胞的活性明显提高(P<0.01)。结论:NK细胞杀伤RPMI 8226细胞的活性较低,其机制与RPMI 8226细胞高表达HLA-Ⅰ类分子、低表达NKG2D配体有关。     

人鼻咽癌顺铂耐药细胞系 (CNE2/DDP)及其亲代细胞 (CNE2)的比较基因组杂交研究

背景与目的：比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)是一种在荧光原位杂交(FISH)技术上发展起来的,用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变(缺失或扩增),并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为全面了解鼻咽癌耐药细胞与药物敏感细胞在基因组DNA水平上可能存在的差异,以及这种差异在肿瘤耐药性产生中的意义,我们用CGH技术对鼻咽癌耐药细胞系(CNE2／DDP)和其亲代药物敏感细胞(CNE2)的基因组DNA进行检测和分析。方法：提取两种癌细胞及正常胎盘组织的基因组DNA,以随机引物法进行荧光标记(CNE2／DDP和CNE2 DNA以Fluorescein-12-dUTP标记,探针显绿色荧光;正常胎盘组织以Tetramethylrhodamine-5-dUTP标记,探针显红色荧光),将标记的DNA探针同时与正常淋巴细胞分裂中期染色体进行杂交,杂交信号在荧光显微镜下经CCD(charge coupled device)摄像装置摄取,并通过荧光数字图像分析系统(quips CGH program)进行数据处理,计算两种荧光的比率并绘制分析图。结果：CNE2细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在1q,3q,5p,6p,7p,8q,9q,11p,12q,19q的扩增和4q,12p,13p,14p,15p,18,20q,21p,22的缺失。从CNE2诱导的耐药细胞系CNE2／DDP恒定表现为8q,19q的扩增和8p的缺失,其它的染色体均未发现明显异常的扩增或缺失。将CNE2／DDP在不含药物的培养基中连续传代培养1个月后重复CGH,发现与连续药物处理的CNE2／DDP结果一致。CNE2／DDP细胞较CNE2细胞具有更为正常和稳定的染色体组成。结论：CNE2／DDP细胞是在耐药诱导过程中选择出来的单一的耐药细胞克隆。肿瘤细胞耐药的产生主要是一个克隆选择过程,即被诱导产生了耐药的细胞克隆在有药物存在的生存压力下被选择出来。     

人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异研究

目的:观察人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异,分析耐药细胞的特点。方法:比较两者在光镜下的形态、生长特点及体外克隆形成率的差异;流式细胞术分析两者细胞周期分布的变化、多药耐药蛋白P-170及ABCG2表达差异;采用MTT法分析耐药谱;动物实验观察两者成瘤差异。结果:光镜下CNE2/DDP细胞呈圆形,CNE2细胞呈多边形;CNE2/DDP生长相对缓慢;CNE2/DDP、CNE2细胞群体倍增时间分别为29.46 h、21.03 h;CNE2/DDP、CNE2细胞G0/G1期分别为(65.77±0.81)%、(44.9±2.21)%,S期分别为(23.63±0.42)%、(39.67±1.27)%,G2/M分别为(10.93±0.25)%、(13.23±0.31)%,两者相比差异均有显著性统计学意义(P<0.01)。CNE2/DDP、CNE2细胞的P-170和ABCG2表达率分别为(75.93±0.86)%、(2.83±0.40)%和(43.37±0.42)%、(4.07±0.59)%,两者差异有显著性统计学意义(P<0.01)。MTT法耐药谱分析表明,CNE2/DDP细胞成瘤前、后对DDP及5氟-尿嘧啶长春新碱(VCR)的耐药指数差异均无统计学意义。动物实验表明,1×106个CNE2/DDP、CNE2细胞皮下接种BALB/c裸鼠均成瘤,CNE2组肿瘤生长迅速。结论:CNE2/DDP细胞株具有多药耐药的特点,可用于耐药鼻咽癌的研究。     

IL-2、IL-15增强免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞的杀伤活性

目的：观察IL2、IL15对免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性的影响。方法：抗CD56磁珠纯化NK细胞后分为4组：（1）编辑前NK细胞组：加入100 U/ml IL2;（2）单纯编辑组：NK细胞与CNE2细胞10∶1混合,加入100U/ml IL2;（3）IL2再培养组：纯化编辑后的NK细胞,加入1 000 U/ml IL2;（4）IL15再培养组：纯化编辑后的NK细胞,加入10 ng/ml IL15。24 h后,流式细胞仪检测各组NK细胞表面NKG2D的表达;LDH释放测定法测定效靶比20∶1时各组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结果：编辑前NK细胞组、单纯编辑组、IL2再培养组、IL15再培养组NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(97.63±0.83)%、(53.50±1.25)%、(94.47±1.00)%、(98.07±0.21)%。IL2、IL15再培养组NK细胞 NKG2D的表达分别比单纯编辑组有显著的增加（P<0.01),该4组NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(35.90±3.27)%、(4.70±2.30)%、(31.70±3.56)%、(40.18±2.94)%,IL2再培养组、IL15再培养组明显提高编辑后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性（P<0.01）, IL15的作用强于IL2。结论：高剂量IL2、IL15可以上调免疫编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,恢复编辑后NK细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性,IL15的作用强于IL2。