AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱

目的　采用扩增片段长度多态性DNA(AFLP)分子遗传标志技术,分析人参、西洋参基因组DNA多态性。方法　人参、西洋参干燥根基因组DNA,经EcoRI/MseI酶切并与其相应的人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增。结果　经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱。结论　AFLP法有望成为一种独立的切实可行的手段,将在人参、西洋参等药用植物的鉴定、生物进化、系统发育研究及指导道地性药材的科学栽培等方面发挥重要作用。     

基于Cytb基因对药用昆虫地鳖虫炮制品的分子鉴别研究

目的:建立基于线粒体DNA细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的分子标记技术对地鳖虫(地鳖、冀地鳖)及其混伪品炮制药材进行分子鉴定的方法。方法:采用改良的饱和氯化钠法对地鳖虫及其混伪品炮制药材的总DNA进行提取。通过通用引物REVCB2H、REVCBJ对所有样品的Cytb基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增;用MEGA 5.1软件对所有样品的Cytb基因序列采用邻接(NJ)法构建系统发育树;并利用DNAMAN软件对得到的所有样品的Cytb基因序列进行比对,分析正品、混淆品间序列差异,在差异较大区域设计特异性引物Esin-F和Esin-R进行分子鉴定。结果:以提取的DNA为模板均能成功扩增出相应的Cytb基因片段;构建的系统发育树与其亲缘关系一致;设计的特异性引物Esin-F和Esin-R在同样的条件下,只有地鳖虫得到了扩增条带。结论:建立了地鳖虫及其混伪品药材炮制品的DNA提取方法;设计的特异性引物对地鳖虫有高度的特异性,能够有效鉴别地鳖虫及其混伪品。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性，建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析，寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物，优化PCR反应体系与程序，进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别，所建立的位点特异性PCR鉴别方法，在退火温度为56℃、循环数为33次时，伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后，在200～300 bp之间检出一条单一DNA条带，而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血，为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定

目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法碱变性法提取新鲜鹿鞭及牛鞭,采用引物设计软件PrimerPremier5.0对鹿鞭及牛鞭的细胞色素b基因序列分析,用于鉴定正品鹿鞭的特异性引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,对鹿鞭进行DNA指纹鉴定。结果对鹿鞭进行mtDNA鉴定图谱显示,真品鹿鞭有306bp条带,伪品没有。结论用此方法对鹿鞭进行鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行。鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于鹿鞭的鉴定。     

基于Cyt b基因的PCR技术对牛鞭药材的鉴定方法研究

目的:建立对牛鞭药材的聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,从分子水平上对牛鞭药材的真伪进行鉴定。方法:提取牛鞭及其伪品(驴鞭、猪鞭、羊鞭)的基因组DNA,并对其完整性、纯度和浓度进行检测。利用GenBank相关信息,以牛鞭的线粒体细胞色素b基因(Cyt b)为靶基因,应用Primer-BLAST在线软件设计特异性引物,并对不同物种鞭类样品进行PCR扩增,对产物进行电泳分析;对获得的牛鞭样本PCR产物进行克隆和DNA测序验证。对所建立的PCR鉴定方法进行特异性和重复性考察验证。结果:提取所得的牛鞭及其伪品DNA的纯度较高,无蛋白质或RNA污染;1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示,牛鞭样本在200～300 bp之间均出现明显的目的基因条带,而其他伪品未见相应条带出现。DNA测序结果证实,所获牛鞭样本基因片段的核苷酸序列与GeneBank中牛鞭物种相似性均为100%。方法学验证结果显示所建方法特异性、重复性均良好。结论:本研究所建基于Cyt b基因的PCR鉴定方法简单、快速,准确性、特异性、重复性均良好,可满足牛鞭及其伪品的分析鉴定需求。     

甘肃产秦艽的DNA指纹图谱鉴别

目的 对产于我国甘肃省的中药秦艽的3种基源植物秦艽、麻花秦艽与小秦艽进行RAPD分析,建立具有鉴别意义的DNA指纹图谱.方法 采用RAPD分子标记对秦艽的基因组DNA进行PCR扩增,利用NTSYSpc 2.1和Popgene 3.2软件分析3种秦艽间的亲缘关系,构建树系图.结果 从80条RAPD引物中筛选出4条具有鉴别意义的多态性引物,在3种秦艽中共得到39个DNA条带,其中共有条带2条,多态条带37条.据此获得了能有效区别3种秦艽的多态性RAPD指纹谱.结论 甘肃产秦艽的3种基源植物遗传分化明显,RAPD方法能有效地将它们区分鉴别.     

用随机扩增多态DNA（RAPD）技术鉴别中药材天花粉及其类似品

目的：对来源于１３个种３个变种的天花粉及基类似品进行鉴别研究,并进行方法学的探讨。方法：应用随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技术进行鉴别,采用聚类分析方法分析并对药材贮存时间及产地对实验结果的影响进行探讨。结果：反天花粉正品与类似品有效地分成三大类。结论：认为在实验采取设对照组,对结果采用聚类分析等方法,ＲＡＰＤ技术鉴别药材具有一定的可靠性和实用价值,这为解决粉未及破碎药材的鉴别提供了新的方法。     

三七的18S rRNA,matK基因序列和HPLC化学指纹图谱分析研究

目的分析中药三七Panaxnotoginseng的18SrRNA和matK基因的分子特征和三七的化学指纹特征,为三七的正品药材基原鉴定提供分子和化学依据。方法采用PCR直接测序技术测定三七及其7种伪品的18SrRNA和matK基因部分核苷酸序列以及不同产地三七的DNA分子特征。利用HPLC的化学分析技术,明确产地对三七化学成分的影响,以及三七不同部位的化学指纹特征。结果(1)三七及其7种常见伪品的核糖体18SrRNA基因序列存在很大的差异。(2)不同产地的三七的核糖体18SrRNA和叶绿体matK基因序列特征完全一致,分别与GenBank上已报道的R1型(D85171)和M1型(AB027526)序列吻合。(3)不同产地的三七HPLC指纹图谱相似。(4)三七不同部位均具有其相对稳定的HPLC指纹特征,其中花、叶具有特有的指纹区,根、须根、剪口、筋条等不同商品规格的HPLC指纹图谱比较相似。结论基因序列标记能从分子水平定性分辨三七及其伪品的遗传背景差异,为中药品种标准化提供了先进可行、稳定可靠的分子标准;HPLC指纹图谱分析可以直观地为三七的化学成分定性,三七不同商品规格的特征性指纹有望成为以其为原材料的各种产品的质控标准,而三七不同部位(尤其是花和叶)的HPLC指纹图谱将有望成为制定三七花、三七叶新药用资源质控标准的依据。     

Authentication of Panax notoginseng by 5S-rRNA spacer domain and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis

The great majority of Panax species are well-known herbal medicines in the Orient, and many of them share a close resemblance in appearance and chemical composition. Among these Panax species, the root of P. notoginseng (Sanqi) is a unique herb that has distinct clinical usage. Here, the 5S-rRNA spacer domains were isolated from P. notoginseng, P. japonicus var. major, P. stipuleanatus, P. quinquefolius, P. ginseng, P. zingiberensis, and P. wangianus, and four common adulterants of P. notoginseng including Curcuma wenyujin, Curcuma longa, Bletilla striata and Gynura segetum. The spacer domains were sequenced and compared, which showed over 75 % DNA identity among all Panax species, but not for the adulterants. In addition, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis was used to distinguish different members of Panax genus as well as the morphological variants of P. notoginseng. These molecular methods could be used in the authentic identification of P. notoginseng from other Panax species.     

LC/MS鉴定中药三七及其复方制剂

目的建立中药三七及其在复方丹参制剂中的特征图谱。方法用LC/MS分析方法,采集三七、人参和西洋参的LC/MS总离子流色谱,从总离子流色谱中提取三七主要化学组分的提取离子流色谱,选择相对稳定、3种药材间差异显著的提取离子流色谱作为三七药材的特征图谱。在相同条件下对比复方丹参的提取离子流色谱与三七的特征图谱;同时用LC/MS/MS对三七中的主要组分进行定性分析。结果与人参皂苷Rg1(m/z 800)和Re(m/z 946)具有相同m/z的提取离子流色谱在3种药材间差异显著,稳定可靠,在复方中有较好的重现性,复方丹参中其他共有成分对其无显著影响。结论三七的LC/MS特征图谱可作为鉴定复方丹参中三七的特征,也可作为鉴别三七和同属其他药材的特征。     

国产西洋参与进口西洋参的比较研究——西洋参中挥发油成分的分析

各产地西洋参挥发油含量为0.040～0.097%。西洋参挥发油经色谱—质谱—计算机联用仪分离鉴定出20种化合物。国产西洋参与进口西洋参的挥发油成分和含量相近。     

国产西洋参与进口西洋参的比较研究——西洋参中挥发油成分的分析

各产地西洋参挥发油含量为0.040～0.097%。西洋参挥发油经色谱—质谱—计算机联用仪分离鉴定出20种化合物。国产西洋参与进口西洋参的挥发油成分和含量相近。     

Identification of Panax species in the herbal medicine preparations using gradient PCR method

In order to identify the existence of Panax species in herbal medicine preparations, the Ginseng specific marker primer was selected and created based on the sequence of Korean ginseng DNA fragment, 359 bp. The gradient PCR was performed on 40 types of the herbal medicines including the 7 types of Araliaceae that are in the same family with the Panax ginseng using the created Ginseng maker primer. As result, Panax notoginseng (Chinese), Panax japonicus (Japanese) and Panax quinquefolius (American), along with Panax ginseng (Korean) were the only ones amplified. However, in the case of Atractylodes lancea, one of the herbal medicines not categorized as Panax species, the DNA was prominently amplified by the Ginseng marker primer. The sequence of the amplified DNA of Atractylodes lancea was identified, resulting in enabling the differentiation from the Panax species by the Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) method. In addition, the results of the gradient PCR performed on the herbal medicine preparations that consists of Panax ginseng showed that 290 bp size of the original DNA fragments of Panax ginseng was amplified on the herbal medicine preparations containing Panax ginseng. Therefore, these results suggest a possibility of creating a new testing method for identifying specific herb medicines using the gradient PCR, a molecular biological method not only on Panax ginseng, but also on other herbal medicines and herbal medicine preparations.     

湿度变化对西洋参品质动态影响及可逆性的光谱成像检测

目的:应用光谱成像技术探讨湿度变化对西洋参品质的动态影响及可逆性。方法:选用中心波长为254 nm的紫外光源激发西洋参样品发射荧光进行在体检测,系统光谱分辨率5 nm,光谱覆盖范围420～680 nm。对存放于不同湿度条件下的3份西洋参检品连续检测,绘制归一化特征光谱图。并用自定义中心波长反映西洋参的品质变化规律。结果:环境湿度变化对西洋参品质量有显著影响,且受潮西洋参饮片经重新干燥处理后,其特征荧光光谱的变化不可逆转。结论:荧光光谱成像技术可用于中药贮藏与养护状况的监测,并具有操作简便、快速、无损等优点。     

Molecular authentication of Panax ginseng and ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region

Panax ginseng and Panax quinquefolius are the most widely used Panax species, but they are known to have different properties and medicinal values. The aim of this study is to develop a robust and accurate DNA marker for identifying P. ginseng and the origins of ginseng products. Two single nucleotide polymorphism (SNP) sites specific to P. ginseng were exploited from nuclear ribosomal external transcribed spacer (ETS) region. Based on the SNP sites, two specific primers were designed for P. ginseng and P. quinquefolius respectively. P. ginseng can be easily discriminated from P. quinquefolius by amplifying the two specific alleles using multiplex allele-specific PCR. Favorable results can also be obtained from commercial ginseng products. The established method is highly sensitive and can detect 1% of intentional adulteration of P. quinquefolius into P. ginseng down to the 0.1ng level of total DNA. Therefore this study provides a reliable and simple DNA method for authentication of the origins and purities of ginseng products.     

西洋参制剂的薄层色谱与薄层扫描鉴别

采用薄层色谱法及薄层及扫描法对市售约一百批次全国各地生产的几种西洋参制剂进行了定性鉴别，方法简便，结果可靠，利用此法能准确区别西洋参制剂与人参假冒西洋参的制剂。