齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别

目的设计出齿瓣石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能完成对齿瓣石斛真伪进行准确鉴别。方法根据齿瓣石斛及其他枫斗类、黄草类石斛的rDNA ITS序列数据库,设计了齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别引物JB-Chiban-01S和JB-Chiban-01X。然后,对38种石斛属植物模板DNA进行了PCR扩增,阳性者即为齿瓣石斛正品。结果当退火温度设定为58℃时,只有齿瓣石斛的模板DNA能被扩增出来,而其他的37种石斛属植物均为阴性。该鉴别反应重复性好,已在鉴别齿瓣石斛时发挥重要作用。结论运用位点特异性鉴别引物能成功地对齿瓣石斛进行PCR鉴别,与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有高效、准确、简便、省时等优点。     

曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和DNA分子证据

目的　探讨曲茎石斛 (南阳居群 )与同属近似种 :细茎石斛 (南阳居群 )、霍山石斛 (霍山居群 )、铁皮石斛(天台居群 )药材鉴别的形态及DNA分子证据。方法　对曲茎石斛 (南阳居群 )及其近似种的药材进行了外部形态和rDNAITS序列比较。结果　曲茎石斛及其近似种药材的外部形态虽无明显区别 ,但在rDNAITS序列上却存在着显著而稳定的差异。曲茎石斛 (南阳居群 )与铁皮石斛 (天台居群 )的rDNAITS序列的差异最小 ,绝对遗传距离为 7;但与细茎石斛 (南阳居群 )及霍山石斛 (霍山居群 )rDNAITS区的差异较大 ,绝对遗传距离分别为 4 0和 4 2。在rDNAITS区域中 ,作者共挑选了 7个碱基位点用作鉴别曲茎石斛 (南阳居群 )及其近似种的DNA证据。结论　根据药材的形态特征及rDNAITS区碱基序列差异 ,可准确鉴别曲茎石斛及其近似种药材。     

曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和DNA分子证据

目的　探讨曲茎石斛(南阳居群)与同属近似种:细茎石斛(南阳居群)、霍山石斛(霍山居群)、铁皮石斛(天台居群)药材鉴别的形态及DNA分子证据。方法　对曲茎石斛(南阳居群)及其近似种的药材进行了外部形态和rDNA ITS序列比较。结果　曲茎石斛及其近似种药材的外部形态虽无明显区别,但在rDNA ITS序列上却存在着显著而稳定的差异。曲茎石斛(南阳居群)与铁皮石斛(天台居群)的rDNA ITS序列的差异最小,绝对遗传距离为7;但与细茎石斛(南阳居群)及霍山石斛(霍山居群)rDNA ITS区的差异较大,绝对遗传距离分别为40和42。在rDNA ITS区域中,作者共挑选了7个碱基位点用作鉴别曲茎石斛(南阳居群)及其近似种的DNA证据。结论　根据药材的形态特征及rDNA ITS区碱基序列差异,可准确鉴别曲茎石斛及其近似种药材。     

霍山地区4种石斛属植物的遗传多态性分析

利用AP-PCR方法对4种霍山来源的石斛属植物基因组DNA进行了多态性分析，从75种随机引物中筛选出10种扩增条带清晰、稳定的随机引物，通过PCR扩增共获得250条DNA片段，其中呈多态性的片段数为165条，占扩增条带数的66％，显示了霍山来源的石斛植物具有较高的遗传多态性；利用NT-syspc分析软件对不同石斛品种间的平均遗传距离进行了分析，并利用UPGMA聚类分析方法构建它们的亲缘关系聚类图，结果表明4种霍山来源的石斛品种具有较近的亲缘关系，它们之间的平均遗传相似系数为0．63，其中铁皮石斛和铜皮石斛的亲缘关系最近，两者间的遗传相似系数为0．78，它们与串珠石斛的遗传相似系数分别为0．6和0．61，与霍山石斛的遗传相似系数分别为0．63和0．58；但是，相对于形态接近的铜皮石斛，铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近。     

铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别

目的采用RAPD分子标记技术，对铁皮石斛8个野生居群的遗传多样性、亲缘关系以及分子鉴别等进行研究。方法筛选随机引物进行RAPD分析，通过UPGMA聚类，研究铁皮石斛各居群间的遗传关系，构建居群亲缘关系的分子系统树；利用特异性条带对铁皮石斛野生居群进行指纹分析鉴别。结果共筛选出10个有效引物，在8个野生居群材料的RAPD扩增中共得到439个位点，平均每个引物扩增出43.9个位点，每个居群扩增出54.9个位点；在所获得的104条可重现谱带中，9条是单态的，95条是多态的，多态性程度达91.35%，遗传距离在0.590～0.727之间，平均为0.686。结论铁皮石斛居群间遗传差异明显，具有较丰富的遗传多样性；RAPD可以作为铁皮石斛野生居群遗传多态性、居群亲缘关系和分子鉴别研究的有效手段；引物S412可以有效鉴别铁皮石斛的8个野生居群。     

中药黄草石斛rDNA ITS序列分析

目的　研究黄草石斛ITS片段遗传多样性,分析该片段在黄草药材DNA分子鉴别和石斛属植物系统学研究中的意义。方法　用一对引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)测序。结果　获得核糖体DNA中ITS和5 8SrDNA完整序列,14个石斛类群的ITS 1与ITS 2序列的长度分别为228-233bp和242-247 bp。石斛种间ITS 1序列的差异百分率为11.79% - 31.58% ,ITS 2序列的差异百分率为10.29% - 25.30% ,金钗石斛种内ITS 1序列的差异百分率为0.87% ,ITS 2序列无差异。石斛各类群与外类群的差异百分率ITS 1序列为23.56% - 36.89% ,ITS 2序列为26.5.2 % - 33.31%。用NJ法根据ITS 1与ITS 2序列数据重建系统发生树。结论　两段序列在石斛种内保守,在种间有较大的差异,与外类群的差异最大,可作为中药黄草石斛分子鉴定的标记,而石斛属的系统发生关系尚须进一步研究     

铁皮石斛的PCR-RFLP鉴别方法

目的:建立铁皮石斛专有的分子鉴别方法。方法:通过对铁皮石斛及其近缘种石斛的叶绿体matk基因序列进行对比分析,根据鉴别位点设计特异的铁皮石斛鉴别引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术进行鉴别。结果:本试验中鉴别引物可成功扩增铁皮石斛及其近缘种石斛,PCR产物为331 bp,铁皮石斛的PCR产物可被Tru9 Ⅰ限制性内切酶切开,而近缘种石斛不能被切开,可通过琼脂糖凝胶电泳成功鉴别。结论:本试验建立的PCR-RFLP鉴别方法可以鉴别铁皮石斛及其近缘种石斛。     

药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究

目的建立简易的采用rDNA ITS区作为分子标记对中药石斛的基源植物进行分子鉴定的技术。方法 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法获得ITS片段的限制性图谱。束花石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Cla I和Apa LI酶切,流苏石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Sph I酶切。结果根据预测的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。结论rDNA ITS的PCR-RFLP可用于鉴定石斛药材的原植物,具有简便、费用低的优点。     

枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别

目的建立枫斗类石斛的rDNA ITS区碱基全序列数据库,利用该数据库对枫斗类石斛待检种进行准确鉴别。方法对枫斗类石斛的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用CLUSTRAL,MEGA等软件以及枫斗类石斛rDNA ITS区全序列数据库对待检种rDNA ITS区进行序列分析鉴别。结果建立了21种枫斗类石斛的rDNA ITS区全序列数据库, 枫斗类石斛在该区的种间差异显著而稳定,转换和颠换总数为11～122,变异位点数为341,信息位点数为195。与外类群植物云南石仙桃间的差异较大,转换和颠换总数为131～161。枫斗类石斛居群间的差异较小,转换和颠换总数为0～6。结论利用枫斗类石斛的全序列数据库及遗传分析软件,通过对待检种rDNA ITS区进行序列测定,可以成功鉴别属于数据库中枫斗类石斛的待检种。     

5种正品石斛的鉴别

目的增补鉴别5种正品石斛方法。方法采用显微与薄层色谱法的鉴别。结果与结论更准确地对5种正品石斛提供检验依据。     

Allele-specific primers for diagnostic PCR authentication of Dendrobium officinale

Based on rDNA ITS sequences of D. officinale and the other 37 species of Dendrobium, a pair of allele-specific diagnostic primers, TP-JB01S and TP-JB01X, were designed to authenticate D. officinale from the other species. Before the diagnostic PCR, the primer pair, P1 and P2, for amplifying the whole ITS region was used to validate template DNA and to obtain the appropriate template DNA for the diagnostic PCR. Diagnostic PCRs were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants as a template. When the annealing temperature was raised to 66 degrees C, only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. The diagnostic PCRs have been repeated many times and have played an important role in authenticating the stems of D. officinale in China. Compared with the authentication method by sequencing DNA fragments, the allele-specific diagnostic PCR is not only simpler and time-saving but also practical and effective.     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测

本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法。在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上，设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明：AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56 ℃，ARMS引物鉴别时的复性温度更宽，为52～58 ℃。在用两种引物对肝素样品进行鉴别时，仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带，而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

Molecular authentication of the traditional Tibetan medicinal plant Swertia mussotii

Swertia mussotii is an important species in Tibetan folk medicine. However, it is quite expensive and frequently adulterated, so reliable methods for authentication of putative specimens and preparations of the species are needed to protect consumers and to support conservation measures. We show here that the chloroplast (cp) DNA RPL16 intron has limited utility for differentiating S. mussotii from closely related species, since the cpDNA RPL16 sequences are identical in S. mussotii and two other species of Swertia. However, the rDNA internal transcribed spacer (ITS) sequences differ significantly between S. mussotii and all of 13 tested potential adulterants. Thus, the ITS region provides a robust molecular marker for differentiating the medicinal S. mussotii from related adulterants. Therefore, a pair of allele-specific diagnostic primers based on the divergent ITS region was designed to distinguish S. mussotii from the other species. Authentication by allele-specific diagnostic PCR using these primers is convenient, effective and both simpler and less time-consuming than sequencing the ITS region.     

金钱白花蛇及其伪品的Cyt b基因片段序列分析和PCR鉴别研究

对金钱白花蛇及其伪、混品药材和原动物的Cyt b基因片段的序列分析发现,该基因片段在金钱白花蛇及其伪品间的差异远远大于金钱白花蛇种内个体间的差异,是理想的用于鉴别金钱白花蛇及其伪混品的分子遗传标记。在对Cyt b基因片段序列分析的基础上,设计了金钱白花蛇PCR鉴别的一对高度特异性引物BuL-1和BuH-1。结果表明,该对引物在对金钱白花蛇的PCR鉴别中,用60℃～65℃的复性温度,可以100%检出金钱白花蛇,误检率和漏检率为0,并能在混合的药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇组份。本研究还表明PCR鉴别将有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定

目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法碱变性法提取新鲜鹿鞭及牛鞭,采用引物设计软件PrimerPremier5.0对鹿鞭及牛鞭的细胞色素b基因序列分析,用于鉴定正品鹿鞭的特异性引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,对鹿鞭进行DNA指纹鉴定。结果对鹿鞭进行mtDNA鉴定图谱显示,真品鹿鞭有306bp条带,伪品没有。结论用此方法对鹿鞭进行鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行。鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于鹿鞭的鉴定。     

Authentication of oviductus ranae and its original animals using molecular marker

Two pairs of diagnostic primers, IHm01-L/IHm01-H and IHm02-L/IHm02-H, for distinguishing the Chinese crude drug Oviductus Ranae from its substitutes were designed based on sequences of Cyt b gene fragment of the original animals of the drug and substitutes. Total DNAs were extracted from crude drugs purchased from five drugstores in different regions, as well as from original animals of the drug, Rana chensinensis, and seven species of related ranid species. Diagnostic polymerase chain reactions (PCRs) were performed using the two pairs of primers with the total DNAs of the original animals as a template. The result showed that a 240 bp DNA segment was clearly amplified from all templates of Rana chensinensis using primers IHmO1-L and IHm01-H, whereas no DNA band appeared from other templates. While using primers IHm02-L and IHm02-H, we got a clear 140 bp DNA band from all the templates of R. huanrenensis and 3 oviducts of the same species, no PCR product was observed from the other samples. A set of PCR reactions was employed to identify crude drugs from the five drugstores using the two pairs of primers together with HsmL1 and HsmH1 reported in our previous study. The results show that only 20% of the Oviductus Ranae currently sold in markets are qualified products and the rest are not.