化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成

目的研究化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2（tissue式分解inhibitor of metalloproleinase-2，TIMP-2）小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对胆总管结扎大鼠肝纤维化形成的影响。方法30只雄性SD大鼠随机均分成5组：正常组、假手术组、模型组、阴性对照组、治疗组，行胆总管双重结扎和经肠系膜上静脉（superior mesenter vein，SMV）皮下置管手术，2周后给予治疗组0．05mg·kg^-1 siRNA经皮SMV注射，每3天1次。6周后取所有动物肝组织标本，经门静脉测压（portal vein pressure，PVP）和腹主动脉取血。常规HE染色和Van Gieson（VG）胶原染色，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量。应用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、I型胶原纤维（collagen type I，COL I）和Ⅲ型胶原纤维（collagentype Ⅲ，COLⅢ）mRNA的表达。应用Western印迹检测TIMP-2蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle antibody，α-SMA）和结蛋白（Desmin）的表达。结果经抗TIMP-2 siRNA干预后，大鼠肝脏组织学病变减轻，PVP降低，血清ALT和AST水平下降，肝组织Hyp含量减少，且TIMP-2、COL I和COL Ⅲ mRNA的表达显著低于模型组，TIMP-2蛋白的表达也显著降低。同时肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）标记物α-SMA和Desmin蛋白的表达均显著低于模型组，尤以α-SMA蛋白表达减少更为明显。结论化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够抑制胆总管结扎大鼠肝纤维化形成，有可能成为肝纤维化治疗的新策略。     

化学合成经修饰抗TIMP-2小干扰RNA对活化HSCs合成分泌ECM影响

目的观察化学合成经修饰抗金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）小干扰RNA（sinNA）对活化肝星状细胞（HScs）合成分泌细胞外基质（ECM）的影响。方法针对TIMP-2靶基因化学合成siRNA_366和siRNA_687，分别以不同浓度和不同时间转染活化HSCs，筛选基因沉默效率较高的一对。再将此siRNA以不同浓度作用于活化HSCs，检测培养细胞上清液中透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）和羟脯氨酸（Hyp）含量，采用荧光实时定量PCR检测TIMP-2、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原纤维（COLI）和Ⅲ型胶原纤维（COLⅢ）mRNA的表达，western印迹检测TIMP-2蛋白表达。结果siRNA687对TIMP-2的沉默效率高于siRNA366。在活化HSCs中应用化学合成经修饰抗TIMP-2siRNA后，各siRNA组α-SMA、COLⅠ和COLⅢ的表达显著降低，且培养细胞上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量也随之减少。结论化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA能够高效抑制TIMP-2的表达，减少HSCs分泌合成ECM，抑制HSCs活化，是治疗肝纤维化的潜在有效方法。     

RNA干扰与抗肝纤维化治疗前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来兴起的一项新技术,它可高效阻抑靶基因表达,不仅可用于研究基因功能,更是一种高效、特异的治疗手段。现就RNAi现象的发现、RNAi机制、意义及抗肝纤维化治疗前景作一简介。     

慢性乙型肝炎肝组织中MMP-2、TIMP-1与肝纤维化关系的研究

为了研究慢性乙型肝炎患者肝纤维化与肝组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其天然抑制物金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的关系,对60例慢性乙型肝炎患者进行肝组织病理活检,其中S_110例,S_224例,S_312例,S_414例。采用苦叶酸天狼猩红染色检测胶原面积百分比,单克隆抗体(McAb)免疫组织化学染色检测MMP-2、TIMP-1阳性细胞的方法进行病理分析。结果显示：慢性乙型肝炎肝组织中胶原面积百分比与肝组织纤维化分期正相关(r=0．885,P=0．000);慢性乙型肝炎肝组织中MMP-2与肝纤维化的分期无关(r=0．034,P= 0．896);慢性乙型肝炎肝组织中TIMP-1和肝纤维化的分期正相关(r=0．760,P=0．000);慢性乙型肝炎肝组织中MMP-2/TIMP-1和肝纤维化分期负相关(r=-0．674,P=0．000)。总之,TIMP-1参与了慢性乙型肝炎肝纤维化纤维化的过程,而MMP-2/TIMP-1是诊断肝纤维化的比较合适的指标。     

辛伐他汀对肝纤维化大鼠Ⅳ-C、MMP-2及TIMP-2表达的影响

目的探讨辛伐他汀治疗肝纤维化的可行性及机制。方法将24只肝纤维化大鼠随机分为药物组、模型组各12只,另取12只正常大鼠作为对照组。模型组不干预,药物组予辛伐他汀5mg／（kg·d）灌胃13周;对照组予等量生理盐水灌胃。13周后取大鼠肝组织,苏木精-伊红染色观察肝组织病理学改变,免疫组织化学方法检测肝组织中Ⅳ型胶原（Ⅳ—C）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）表达。结果与对照组比较,模型组肝组织炎症明显、Ⅳ-C表达与沉积增加,TIMP-2蛋白表达显著增加（P均〈0．05）,MMP-2蛋白表达变化不明显。药物组肝脏炎症较轻,相对模型组Ⅳ—C显著减少,MMP-2蛋白表达增多,TIMP-2蛋白表达减少。结论辛伐他汀可以在一定程度上减轻肝纤维化程度,其机制可能是抑制TIMP-2表达、增加MMP-2表达、促进Ⅳ-C降解。     

抑制金属蛋白酶组织抑制因子-2在肝组织中的表达对大鼠肝纤维化发展的影响

我们前期应用反义寡核苷酸技术，以金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1基因为靶基因，研究发现抑制TIMP-1的表达可阻止大鼠肝纤维化的发展。肝纤维化时，肝内增生的胶原蛋白主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原的增生沉积并不占主要地位，但Ⅳ型胶原过度沉积可使肝血窦毛细血管化，肝血流和结构改变，从而加剧肝脏病变。TIMP-2是肝组织内Ⅳ型胶原酶，即基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的主要抑制因子，     

肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究

目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA 干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com（含有CTGF和TIMP-1）,进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF ＋TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组（Com组,20±2%,P〈0.05）;在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF＋TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%（P〈0.05）.结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.     

抗结缔组织生长因子小干扰RNA对鼠原代肝星状细胞增殖的影响

细胞外基质（ECM）积聚与活化肝星状细胞（HSC）数量密切相关，增殖是活化HSC的重要生物学特性之一，也是调控活化HSC数量的一种重要方式，结缔组织生长因子（CTGF）主要由活化HSC产生，是HSC增殖的一个重要刺激因子。     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

以TIMP-2为靶基因的反义寡核苷酸对肝纤维化大鼠肝功能生化和肝纤维化指标的影响

目的探讨以基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）为靶基因的反义寡核苷酸对肝纤维化大鼠肝功能生化和肝纤维化指标的影响。方法免疫诱导型大鼠肝纤维化模型制备过程中,尾静脉注射针对TIMP-2的反义寡核苷酸。模型制备结束后,检测AⅡ、ALP、TBil、DBil等肝功能生化指标和血清HA、Ⅳ-C、PCHI水平等肝纤维化指标,并测定肝组织羟脯氨酸含量,分析治疗组与其他实验组间的差异。结果治疗组肝功能生化各指标均优于模型组和秋水仙碱组;治疗组肝纤维化生化指标与模型组和秋水仙碱组相比,其数值较低,但差异不显著;治疗组肝组织羟脯氨酸含量显著低于模型组和秋水仙碱组。结论抑制TIMP-2在肝组织中的表达可抑制细胞外基质（ECM）在肝组织内的沉积,降低肝纤维化大鼠肝脏功能的损害。     

实验性肝纤维化大鼠肝脏中TIMP-2基因及蛋白表达阻断研究

目的:探讨以TIMP-2为靶基因,应用反义寡核苷酸 (asON)技术抑制其在肝组织中的表达对大鼠肝纤维化发展的影响．方法:22只大鼠分为治疗组(n=6)、模型组(n=6)和正常对照组(n=10)．以人血白蛋白免疫攻击方法制备免疫诱导型肝纤维化大鼠模型．模型制备过程中,治疗组大鼠以尾静脉注射方式给予针对TIMP-2的硫代反义寡核苷酸．RT-PCR、原位杂交、免疫组化、ELISA 等方法检测TIMP-2的转录以及表达水平．用病理学检查以及Ⅰ、Ⅳ型胶原的免疫组化结果分析肝纤维化发展程度．通过胶原纤维特殊染色及电镜等观察asON对大鼠肝纤维化的影响．结果:治疗组病理学分级状况优于模型组(u=2．071, P<0．05)．治疗组血清TIMP-2低于模型组(T=55, P<0．05),高于正常对照组(T=55,P<0．05)．治疗组肝组织TIMP-2 mRNA表达弱于模型组(t=3．332,P<0．05), 高于正常对照组(t=5．550,P<0．05)．Ⅳ型胶原免疫组化图像定量分析结果显示,治疗组与模型组有显著差异(t =2．310,P<0．05),其表达较低,但仍高于正常对照组(t= 3．623,P<0．05)．治疗组Ⅰ型胶原免疫组化图像扫描结果与模型组相比,其数值亦较低(t=2．845,P<0．05)．治疗组肝窦基底膜胶原沉积较轻,与模型组无明显差异．结论:抑制TIMP-2在肝组织中的表达可以减缓大鼠肝纤维化发展．     

腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响

目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况.方法 将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况.结果 经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01),而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P＜0.01).结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达.     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA防治大鼠肝纤维化研究

目的探讨经门静脉注射抗结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)是否能在体内抑制大鼠肝CTGF基因表达及防治大鼠肝纤维化。方法雄性SD大鼠24只,均分成4组,模型组皮下注射40%CCl4(3ml/kg)及门静脉注射生理盐水,每3d1次,连续6周;预防组皮下注射CCl4及门静脉注射抗CTGFsiRNA(0.1mg/kg),每3d1次,连续6周;治疗组皮下注射CCl42周,随后再给予抗CTGFsiRNA及CCl44周;对照组门静脉注射生理盐水6周。于最后1次CCl4注射后3d行门静脉测压,并取血及组织标本,检测血清转氨酶、透明质酸(HA)及Ⅲ型前胶原(PⅢNP)浓度,应用RTPCR及Western印迹法检测CTGFmRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用HE及Siriusred胶原染色检测肝组织炎症及纤维化,应用偏光扫描对肝组织胶原染色面积进行定量。结果与模型组相比,预防组及治疗组大鼠肝组织CTGFmRNA及蛋白质表达显著下调,肝组织炎症、坏死及纤维化明显减轻,血清转氨酶、HA及PⅢNP浓度显著降低;预防组、模型组和治疗组的肝组织胶原染色面积分别为5.8%±0.8%、12.3%±0.8%和7.2%±0.9%(P<0.01);门静脉压力分别为(14.2±2.3)cmH2O、(20.6±5.8)cmH2O和(15.1±3.6)cmH2O(P<0.05),明显降低。结论经门静脉注射抗CTGFsiRNA能在体内显著抑制大鼠肝CTGF基因表达并能有效防治大鼠肝纤维化,提示抗CTGFsiRNA有潜力成为防治肝纤维化的一种新策略。     

复方黄芪颗粒对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2、金属蛋白酶组织抑制因子-2蛋白表达的影响

目的：探讨复方黄芪颗粒对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）蛋白表达的影响。方法：应用Chevallier半定量计分系统，病理组织学观察等方法，结合细胞外基质（ECM）特殊染色动态变化观察，分析高、低剂量FFHQKL治疗猪血清诱导肝纤维化大鼠的各时间段肝组织学及ECM量的变化，评估复方黄芪颗粒的抗肝纤维化疗效；应用免疫组织化学染色观察造模结束时以及药物治疗各时间段肝组织内MMP-2、TIMP-2表达量的变化。结果：与模型组比较，高、低剂量复方黄芪颗粒治疗第2个月、3个月结束时，大鼠肝组织Chevallier纤维化评分均明显减少（P〈0．01）。复方黄芪颗粒高、低剂量治疗组大鼠在治疗第2个月、3个月结束时，TIMP-2蛋白表达明显减弱，MMP-2蛋白表达明显增强，与模型组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：复方黄芪颗粒可以在蛋白水平增强MMP-2酶蛋白的表达，同时抑制TIMP-2酶蛋白的表达，促进ECM的降解，从而达到逆转肝纤维化的目的。     

秋水仙碱对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-1及其抑制因子-1表达的影响

目的 观察秋水仙碱对纤维化肝脏基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,从胶原降解的角度探讨秋水仙碱对肝纤维化有无逆转作用及可能存在的机制.方法 制备免疫性大鼠肝纤维化模型,并给予秋水仙碱治疗;通过RT-PCR检测MMP-1、TIMP-1的表达,并作Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组化以及Masson胶原染色.结果 发现秋水仙碱对肝纤维化大鼠MMP-1的表达无明显影响(P>0.05),但可以抑制TIMP-1的表达(P<0.05),促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解(P<0.05);然而在病理形态学的观察中,未发现秋水仙碱治疗组与肝纤维化模型组之间存在的显著性差异(P>0.05).结论 秋水仙碱可以抑制纤维化肝脏TIMP-1的表达,从而增强间质胶原酶的活性,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解,产生抗肝纤维化的作用,但其作用有限.     

反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的　观察反义金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP 1)表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法　运用重组DNA技术构建反义TIMP 1真核细胞表达质粒 ,经与糖化多聚赖氨酸偶联后 ,尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内 ;通过Northern印迹法、RT PCR、Western印迹法检测外源导入基因的表达 ,并通过肝组织间质胶原酶活性和羟脯氨酸测定 ,以及肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学与VanGieson染色观察反义TIMP 1质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果　外源导入基因可在肝组织中获得确切表达 ,其表达可增加间质胶原酶的活性 (P <0 .0 1) ,减少羟脯氨酸含量 (P <0 .0 1) ,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解 (P <0 .0 1) ,并促进肝脏病理形态一定程度的改善 (P <0 .0 1)。结论　反义TIMP 1表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA防治大鼠肝纤维化的研究

目的 探讨经腹腔注射抗结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)是否能抑制大鼠体内肝脏CTGF基因表达及防治大鼠肝纤维化.方法 雄性SD大鼠30只,随机分成5组,分别为模型组腹腔注射40%CCl4 (3 mL/kg)及尾静脉注射生理盐水,1次/3 d,连续8周;预防组腹腔注射40%CCl4 及尾静脉注射...     

基质金属蛋白酶—1,反义金属蛋白酶组织抑制因子—1表达质粒？…

目的 观察基质金属蛋白酶－１（ＭＭＰ－１）,反义金属蛋白酶组织抑制因子－１（ＴＩＭＰ－１）表达质粒对大鼠肝纤维经的影响。方法 运用重组ＤＮＡ技术,构建大鼠ＭＭＰ－１,反义ＴＩＭＰ－１,真核细胞表达质粒,经脂质包埋后,利用腹腔注射将其导入免疫性大鼠纤维化模型体内,观察其对大鼠肝纤维化的影响。结果 ＭＭＰ－１,反义ＴＩＭＰ－１表达质粒均可促进肝脏中Ⅰ,Ⅲ型胶原的降解（Ｐ〈０．０５－Ｐ〈０．０１）,且作