AML—M2a型细胞诱导自本及导体优势增殖TCRVβ亚家族T细胞的研究

目的：研究急性髓细胞性白血病M2a亚型（AML－M2a）患者外周血白血病细胞反应性T细胞受体V区β链（TCRVβ）亚家族T细胞体内外优势表达情况及其体外细胞毒性分析。方法：采用混合淋巴细胞／肿瘤细胞培养法（MLTC）将AML－M2a细胞与自体或正常人外周血T细胞体外混合培养和扩增,用反转录－多聚酶链反应（RT－PCR）分析MLTC前后患者和正常人T细胞TCR24个Vβ亚家族的表达情况,同时用四甲基偶氮唑盐（MTT）法对其进行细胞毒性分析。结果：AML－M2a患者和正常人T细胞在MLTC培养后均出现了TCRVβ亚家族优势表达情况,与淋巴因子激活镣伤细胞（LAK细胞）相比具有较高特异性的细胞毒性（P＜0．01）。结论：AML－M2a细胞可以诱导自体与异体特异性细胞毒性T细胞（CTL）,且其主要为一些优势的TCRVβ亚家族T细胞。     

AML-M2a细胞体内外诱导TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖情况的研究

为了解AML-M2a细胞体外诱导TCRVβ亚家族T细胞的表达和克隆性增殖情况，利用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养（MLTC）体外获取AML-M2a细胞诱导的T细胞，并以RT-PCR扩增4例M2a患外周血单个核细胞和4例AML-M 2a细胞诱导的T细胞中的24个TCRVβ亚家族基因的互补决定区3（CDR3），阳性产物进一步经基因扫描分析从而确定AML-M2a细胞体内外诱导的TCRVβ亚家族T细胞的克隆性增殖情况，结果显示：4例AML-M2a细胞体内外诱导的Vβ亚家族T细胞表达情况相似，其中3例AML-M2a细胞体内外诱导的一个或两个Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖特点，结论：AML-M2a细胞体内外选择性诱导不同的TCRVβ亚家族T细胞克隆性增殖可能是患T细胞对AML-M2a细胞相关抗原刺激所产生的一种特异性细胞免疫反应，体内外环境的不同对Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖情况有一定的影响。     

急性单核细胞白血病患者外周血和骨髓TCR Vβ亚家族 T细胞的倾斜性分布特点

采用RT-PCR扩增急性单核细胞白血病(AML-M5)患者外周血和骨髓单个核细胞的TCR Vβ 24个亚家族基因,分析其TCR Vβ亚家族的利用情况.结果发现,不同标本中可检测到1-19 Vβ亚家族的T细胞,不同患者外周血和骨髓中TCR Vβ亚家族T细胞分布不尽相同.研究结果提供了AML-M5患者外周血和骨髓中TCR Vβ T细胞倾斜性分布的细胞免疫功能改变特点.     

Ph+和Ph-CML病人外周血TCR Vβ T细胞分布特点

为了解Ph^ 和Ph^-慢性粒细胞白血病（CML）病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布特点，利用RT－PCR分别扩增13例CML病人（Ph^ -b3a2型5例，Ph^ -b2a2型5例，Ph^-型3例）外周血单个核细胞的TCR Vβ的24个亚家族基因片段，了解病人各Vβ亚家族的利用情况。研究结果：发现与正常人有所不同，病人仅存在部分TCR Vβ亚家族T细胞，Ph^ -b3a2型CML表达4－16（平均10．2）个Vβ亚家族，Ph^ -b2a2型CML表达8－11（平均8．8）个Vβ亚家族，而Ph^-者表达506（平均5．7）个Vβ亚家族。各病人表达的Vβ亚家族分布有所不同，在Ph^ (b3a2型）全部病人表达Vβ10和Vβ16，其次为Vβ9和Vβ22；Ph^ （b2a2型）除与Ph^ (b3a2型）相同全部病人表达Vβ10和Vβ16外，还全部表达Vβ24，其次为Vβ8；而Ph^-者全部表达Vβ24，其次为Vβ3，Vβ10，Vβ13和Vβ22。结论：提示Ph^ 和Ph^-CML病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞存在倾斜性分布现象，不同类型CML病人T细胞的TCR Vβ选择性利用有所不同，这可能与CML细胞相关抗原的差异以及个体特异性免疫反应的差异有关。     

急性早幼粒细胞白血病患者中TCR Vβ T细胞体内外克隆性增殖的比较

为了解急性早幼粒细胞白血病(APL)患者T细胞在体内或体外经诱导后TCR Vβ亚家族的分布和克隆性增殖特点。利用T淋巴细胞液体培养法。在rhIL—2和抗CD3单抗条件下诱导扩增APL患者单个核细胞，并应用RT-PCR分别扩增培养前后患者T细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的互补决定区3(CDR3)片段。了解各Vβ亚家族的表达情况；对阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度。了解T细胞克隆性。结果发现，APL患者T细胞仅表达部分Vβ亚家族。但经体外培养后可检测到部分新增TCR Vβ亚家族T细胞。全部患者存在某些。TCR Vβ亚家族的克隆性增殖T细胞。2例患者均出现相似的Vβ1，Vβ3，Vβ7，Vβ16和Vβ20 T细胞的克隆性增殖情况。结论：T细胞的体外培养可诱导某些Vβ亚家族的表达。在T细胞培养不同时间中，呈持续克隆性增殖的TCR Vβ亚家族T细胞可能是患者T细胞对APL白血病细胞相关抗原的特异性免疲应答。     

慢性粒细胞白血病患者外周血初始T细胞水平和T细胞受体Vβ谱系利用特点

目的了解慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血初始(naive)T细胞的水平和T细胞受体(TCR)Vβ基因谱系利用和克隆性,从而了解CML患者的胸腺近期输出功能和TCRVβ亚家族T细胞增殖情况。方法采用实时定量PCR(TaqMan)方法检测20例CML患者外周血单个核细胞中T细胞受体重排删除环(Tcellreceptorrearrangementexcisioncircles,TREC)的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3+细胞中TREC水平。利用逆转录PCR和基因扫描分析其中14例患者外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族基因表达和克隆性。9名正常人外周血作为对照。结果CML患者外周血TREC含量(0.06±0.16/1000CD3+细胞)明显低于正常人(6.84±4.71/1000CD3+细胞,P<0.01)。14例CML患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族(1～12个),其中13例CML患者外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞,Vβ3,Vβ10,Vβ19,Vβ21和Vβ22亚家族的克隆性增殖多见。结论CML患者胸腺近期输出初始T细胞功能明显降低,但仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞,提示尽管整体T细胞免疫功能低下,但对白血病细胞相关抗原仍具有一定特异性免疫反应的能力。     

急性髓系白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖分析

本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCRVB亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能．尤其是对抗白血病功能的影响。应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRBV24个家族的基因序列,通过基因扫描（genescan）的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞的Vβ亚家族的应用、克隆性增殖、T细胞的复杂性以及T细胞免疫表型的变化。结果表明：11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞均表达部分TCR Vβ亚家族,经体外诱导后TCR Vβ亚家族表达增加;完全缓解期患者外周血T细胞TCRVβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常;4例患者在复发时TCR Vβ亚家族表达数量明显下降;11例患者中有9例在初诊时外周血有1至2个TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态;AML白血病患者初发及复发时T细胞CDR3复杂性明显降低,呈偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善。结论：AML白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族呈限制性表达;在大多数病例中无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导、甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在;在部分病例中某些Vβ亚家族在上述不同疾病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关;在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复。     

弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血T细胞受体Vα与T细胞受体Vβ亚家族T淋巴细胞的分布与克隆性增殖特点

目的 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者外周血T淋巴细胞表达的T细胞受体(TCR)Vα与TCR Vβ亚家族基因谱系及克隆性增殖情况.方法 选取2006年4～5月及7月,于广州医科大学附属第一医院肿瘤血液科收治的3例DLBCL患者作为研究对象,并纳入研究组;选取同期于本院体检的3例健康个体纳入对照组.本研究遵循的程序符合广州医科大学附属第一医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,分组征得受试对象本人的知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.两组受试对象性别与年龄等一般临床病历资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05).通过本院检验科采集研究组与对照组血液10 mL,采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增两组受试者外周血T淋巴细胞中29个TCRVα与24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR)3,采用基因扫描分析两组RT-PCR产物的CDR3序列及其长度.回顾性分析研究组和对照组的临床数据:对比分析TCR Vα与TCR Vβ亚家族基因在两组受试者T淋巴细胞中的表达情况,以及分析研究组T淋巴细胞克隆性增殖的特点.结果 ①与对照组外周血T淋巴细胞表达全部的29个TCR Vα与24个TCR Vβ亚家族基因不同,研究组3例DLBCL患者外周血T淋巴细胞表达TCR Vα亚家族基因成员的数量为20～22个,表达TCR Vβ亚家族基因成员的数量为9～17个.②3例DLBCL患者均存在寡克隆、双克隆或克隆性增殖趋势的T淋巴细胞,其中克隆性增殖T淋巴细胞表达TCR Vα亚家族基因成员主要为TCR Vα6、Vα8、Vα14、Vα15、Vα21、Vα22、Vα23及Vα25.克隆性T淋巴细胞表达TCR Vβ亚家族基因成员主要为TCR Vβ1、Vβ3、Vβ13、Vβ15及Vβ16.表达TCR Vα6、Vα8、Vα14、Vα15、Vα23及TCR Vβ13、Vβ15亚家族基因的T淋巴细胞均全部为克隆性增殖T淋巴细胞.TCR Vα6、Vα23亚家族T淋巴细胞与TCR Vβ3、Vβ13亚家族T淋巴细胞呈明显克隆性增殖,基因扫描分析所得图形接近单克隆图形.结论 DLBCL患者外周血TCR Vα与TCR Vβ亚家族T淋巴细胞均呈优势利用及克隆性增殖的特点.     

去甲基化KG1a细胞DNA对人外周血单个核细胞杀伤活性和T细胞受体Vαβ T细胞增殖的影响

目的:研究去甲基化的急性髓性白血病细胞KG1a的DNA体外诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的杀伤活性和T细胞受体Vαβ(αβ chain variable gene of T cell receptor,TCR Vαβ)谱系的表达和克隆情况.方法:去甲基化试剂盒对KG1a细胞去甲基化处理,并提取其DNA.应用乳酸脱氢酶释放法检测DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性,应用RT-PCR方法扩增各组外周血T细胞的32个TCR Vα亚家族和24个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果:基因扫描显示去甲基化的KG1a细胞DNA可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,且在效靶比为20:1时去甲基化的KG1a细胞DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性差异有统计学意义(P＜0.05).结论:去甲基化的KG1a细胞DNA可提高PBMC杀伤活性,且诱导T细胞呈克隆性增殖.     

基因扫描分析B-CLL的TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性

利用RT-PCR扩增12例B-CLL外周血单个棱细胞的TCR Vβ基因24个亚家族的互补决定区3(CDR3)．以了解T细胞的表达情况。PCR产物进一步经基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果显示：12例BCLL共表达13个TCR Vβ亚家族T细胞，每例病人仅表达3—9个 Vβ亚家族，主要为Vβ3，Vβ6，Vβ7，Vβ17或Vβ19，9制病人的一个或两个Vβ3家族T细胞呈克隆性生长。提示B-CLL选择性地表达TCR vβT细胞。大部分B-CLL出现克隆性增殖T细胞，这可能是对白血痛细胞相关抗原的免疫反应。     

bcr3-ab12多肽诱导脐血T细胞受体Vβ亚家族T细胞克隆性增殖的研究

目的　了解bcr3 abl2多肽诱导T细胞受体 (TCR)Vβ亚家族T细胞克隆性增殖情况。 方法　以人工合成bcr3 abl2多肽联合IL 2 抗CD3单克隆抗体 (单抗 )诱导脐血T细胞增殖 ,运用RT PCR 基因扫描技术分析其TCRVβ亚家族的利用和克隆性特点。结果　bcr3 abl2多肽成功诱导 3份脐血单个核细胞 (MNC)产生多肽特异T细胞。bcr3 abl2多肽和CD3单抗 IL 2均可诱导脐血T细胞扩增 ,多肽诱导的新增Vβ亚家族表达与不加多肽的CD3单抗 IL 2诱导组的T细胞不完全相同。培养前和单用CD3单抗 IL 2诱导后的T细胞绝大多数为多克隆性 ,而bcr3 abl2多肽诱导 1周或 2周后 ,分别在 3例脐血中诱导出寡克隆增殖和呈寡克隆增殖趋势T细胞。结论　bcr3 abl2多肽可在体外诱导出抗慢性粒细胞白血病细胞的脐血特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,该CTL作用可能是由优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞所介导。     

从一例慢性嗜酸性粒细胞白血病发现克隆性增殖T淋巴细胞

利用TCRβV基因指纹图谱分析1例慢性嗜酸粒细胞白血病(CEL)患者的外周血T细胞克隆变化，了解与CEL疾病相关的T细胞受体(TCR)β可变区主要接触抗原的CDR3序列特征。用RT—PCR扩增CEL患者的外周血TCRβV1—24个家族的基因序列，在变性测序胶上电泳，形成TCRβV基因指纹图谱，切割克隆性增生的电泳条带进行测序分析。结果显示：TCRβV基因指纹图谱在βVl3．2家族中的分子量较小处出现一条明显扩增的条带，切割此条带并测序证实为单克隆性T细胞增殖，其CDR3的氨基酸序列为：SFSYEQY，其中SFSY基序为特异性保守序列，其它家族无异常改变。结论：该CEL患者TCRβVl3.2家族中出现了单克隆性增殖的T淋巴细胞群，可能是针对CEL恶性肿瘤细胞反应性增生的T细胞克隆。     

免疫性血小板减少征患者外周血T细胞受体β链V区亚家族的表达及临床意义

目的探讨免疫性血小板减少征患者外周血T细胞受体β链V区亚家族的表达及临床意义。方法选取52例健康人作为健康对照组,52例免疫性血小板减少征患者作为ITP组,分离健康对照组和ITP组常规治疗前后的外周血T细胞,采用流式方法检测TCR Vβ24个亚家族的表达情况。结果与健康对照组24个亚家族几乎全部表达比较,ITP组治疗前平均表达(10.82±4.56,范围:6~16)个Vβ亚家族,Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24均表现为低表达或无表达;ITP组治疗后平均表达(18.54±5.02,范围:13~24)个Vβ亚家族,Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达均有所恢复,ITP组治疗前与健康对照组,ITP组治疗前、后分别比较,Vβ亚家族的表达差异均有统计学意义(P0.05)。结论免疫性血小板减少征的发生发展过程与TCR Vβ24个亚家族的表达具有相关性,监测外周血中TCR Vβ24个亚家族的表达情况能协助免疫性血小板减少征患者的临床诊治,具有较大的推广价值。     

T细胞受体Vβ基因谱系分析在血液肿瘤研究中的应用

分析T细胞受体(TCR)Vβ基因谱和CDR3长度可以确切了解TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性。目前TCR Vβ基因谱分析已广泛应用于判断血液肿瘤和免疫相关疾病患者的免疫功能状态及某些致病克隆的确定；评价不同造血干细胞移植后的免疫重建；探索性区分临床移植物抗白血病效应和移植物抗宿主病；以及为血液肿瘤的免疫靶向治疗提供依据等。     

T细胞受体Vβ基因谱系分析在血液肿瘤研究中的应用

分析T细胞受体(TCR)Vβ基因谱和CDR3长度可以确切了解TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性。目前TCR Vβ基因谱分析已广泛应用于判断血液肿瘤和免疫相关疾病患者的免疫功能状态及某些致病克隆的确定;评价不同造血干细胞移植后的免疫重建;探索性区分临床移植物抗白血病效应和移植物抗宿主病;以及为血液肿瘤的免疫靶向治疗提供依据等。     

应用RT-PCR分析真性红细胞增多症病人TCRVβ亚家族T细胞的表达

近几年,国外相继报道对T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因的分析,从而了解肿瘤或自身免疫性疾病病人的细胞免疫功能状态,并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的实验依据。本文利用RT-PCR方法分析3例真性红细胞增多症病人Vβ亚家族T细胞的表达情况。     

一例慢性移植物抗宿主病患者TCR Vβ T细胞分布和克隆性的研究

目的　了解非血缘关系骨髓移植后慢性移植物抗宿主病 (cGVHD)患者的T细胞受体(TCR)VβT细胞的分布和克隆性。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增 1例非血缘关系骨髓移植后cGVHD患者的外周血单个核细胞的TCRVβ 2 4个亚家族的CDR3,了解患者TCRVβT细胞的分布情况 ,PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性。结果　患者存在 8个TCRVβ亚家族T细胞 ;其中Vβ2、Vβ3、Vβ8和Vβ13亚家族为克隆性增殖T细胞。 结论　患者外周血出现不均匀性 (即倾斜性 )分布和克隆性生长TCRVβ家族T细胞 ,它可能与cGVHD的发生有关。     

非霍奇金淋巴瘤病人外周血T细胞TCR Vβ谱系的选择性利用和克隆性增殖分析

为了解B细胞性非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）和T细胞性非霍奇金淋巴瘤（T－NHL）病人TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性的情况，利用RT－PCR分别扩增4例B－NHL和2例T－NHL病人外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3，了解病人各Vβ亚家族的利用情况。阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度，以了解T细胞克隆性。结果显示，6例NHL病人外周血T细胞仅选择性表达6－12个Vβ亚家族，全部病人均选择了表达Vβ，Vβ8，Vβ13和Vβ19，5例病人表达Vβ2和Vβ16，而全部病人均未能检测到Vβ4－6，Vβ10－12，Vβ15，Vβ17－18，Vβ20，Vβ22－23。基因扫描发现2例B－NHL和1例T－NHL病人的1－3个Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖。结论提示，B－NHL和T－NHL病人外周血T细胞具有相似的Vβ亚家族选择性利用的特点，部分病人存在与肿瘤细胞抗原相关的克隆性增殖的T细胞。     

去甲基化KG1a细胞对人外周血单个核细胞杀伤活性和TCRVαβ T细胞增殖的影响

摘 要 目的：研究去甲基化的急性髓性白血病细胞KG1a的DNA体外诱导人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的杀伤活性和T细胞受体Vαβ（αβ chain variable gene of T cell receptor,TCRVαβ）谱系的表达和克隆情况。方法：去甲基化试剂盒对急性髓性白血病细胞KG1a进行去甲基化处理,并提取其DNA。应用LDH释放法检测DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性,应用RT-PCR方法扩增各组外周血T细胞的32个TCR Vα亚家族和24个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性。结果：基因扫描显示去甲基化的KG1a细胞DNA可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,且在效靶比为20：1时去甲基化的KG1a细胞DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：去甲基化的KG1a细胞DNA可提高PBMC杀伤活性,且诱导T细胞呈克隆性增殖。     

应用TCRVβ基因谱分析血液病与免疫性疾病的T细胞克隆性

在T细胞受体(TCR)β基因重排过程中,其Vβ,Dβ和Jβ结合的多样化和N区核苷酸的随机插入(称为互补决定区3,CDR3)使TCR β链序列呈现高度多样性,故利用TCR Vβ亚家族的特异性引物检测CDR3的长度可以作为一种新的、特异的方法用于T细胞克隆性的分析。近期已有报道分析白血病、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、淋巴瘤、移植物抗宿主病、HIV感染、艾滋病(AIDS)、类风湿和系统性硬化症等病人的外周血T细胞克隆性。结果提出上述病人的TCR Vβ T细胞出现倾斜性分布和克隆性生长的情况。该研究对于了解机体对与疾病相关的抗原的免疫反应,以及探讨如何利用这种T细胞克隆性生长的特点改善临床上对相关疾病的生物学和免疫学的治疗有十分重要的意义。