纳米载体介导的hTERT反义核酸对食管癌细胞生物活性的影响

目的：研究聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒（ polybutylcyanoacrylate nanoparticles, PBCA-NPs, NPs ）介导的端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transeriptase, hTERT）基因反义寡核苷酸 （antisense oligodeoxynucleotide, ASODN）对食管癌细胞EC9706生物活性的影响。方法：采用乳化聚合法制备聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒作为转染寡核苷酸（SODN）的载体，利用激光粒度分析仪和原子力显微镜测定制备NPs的粒径及zeta电位；以NPs介旱8条不同hTERT ASODN（NPs—ASODNⅠ、NPs—ASODNⅡ、NPs—ASODN Ⅲ、NPs—ASODNⅣ、NPs—ASODNⅤ、NPs—ASODNⅥ、NPs—ASODNⅦ和NPs—ASODNⅧ）转染食管癌细胞EC9706，采用MTT法检测转染后对EC9706细胞增殖的影响；采用RT-PCR检测hTERT mRNA表达情况；流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：所制NPs粒径均匀、zeta电位较高，较为理想；以NPs介导hTERT ASODN转染24h时，EC9706细胞增殖被明显抑制，该抑制作用随转染时间的延长和浓度的增高依次增强，与细胞对照组相比有显著差异（P〈0．05）；且不同ASODN转染后对EC9706细胞抑制率不同。单纯NPs组、正义寡核苷酸NPs—SODN组和单纯ASODN组转染后对EC9706细胞增殖无明显抑制作用（P〉0．05）。NPs—ASODN转染EC9706细胞72h时，hTERT mRNA表达水平明显降低，与细胞对照组相比有显著差异（P〈0．05）。NPs—ASODN转染72h时，NPs—ASODNⅠ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ转染组EC9706细胞出现明显凋亡现象（P〈0．05），而NPs—ASODNⅡ、Ⅲ、Ⅳ转染组EC9706细胞未发生明显的凋亡现象（P〉0．05）。结论：聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒可以作为一种良好的基因载体，在其介导下hTERT ASODN能有效抑制食管癌细胞EC9706的增殖和hTERT mRNA的表达，并能诱导细胞凋亡。提示该纳米粒作为一种新型纳米载体为食管癌的基因治疗提供了一条新的途径。这种抑制作用具有时间和浓度依赖性，并具有序列特异性，表明hTERT基因不同位点在端粒酶活性中所起的作用可能不同.     

Survivin反义寡核苷酸抑制EC9706细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的 观察Sunrivin反义寡核苷酸(ASODN)对人食管癌细胞系EC9706细胞增殖和凋亡的影响.方法 人工合成Survivin基因反义和正义ODN,并进行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径分别转染 EC9706 细胞;应用 RT-PCR 和 Western Blot 检测 SurvivinmRNA和蛋白表达;应用MTT法检测 Survivin ASODN 对 EC9706 细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率.结果 体外培养的 EC9706 细胞可表达较强的 Survivin mRNA 和蛋白;Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 Survivin mRNA 和蛋白表达,50μmoL/L ASODN 几乎可以完全抑制.MTT 研究结果表明,Survivin ASODN 可呈浓度依赖性地抑制 EC9706 细胞增殖,50μmol/L ASODN 对细胞生长的抑制率可达78.5%,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M 期.Survivin SODN 对 Survivin mRNA 和蛋白以及 EC9706 细胞的增殖和细胞周期无明显的抑制作用.结论 脂质体介导转染 Survivin 反义寡核苷酸可抑制细胞增殖、诱导细胞G2/M 期阻滞而促进细胞凋亡.     

hTERT反义寡核苷酸对脊索瘤细胞周期及增殖的影响

目的:探讨hTERT反义寡核苷酸(ASODN)抑制CM-319细胞端粒酶活性对脊索瘤细胞的细胞周期及增殖的影响。方法:用脂质体介导hTERT正义寡核苷酸(SODN)和反义寡核苷酸(ASODN)转染CM-319脊索瘤细胞株72小时后,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果:hTERT的ASODN转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测显示:ASODN组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期,而hTERT的SODN则无此作用。ASODN组细胞凋亡率为16.01%,而hTERT的SODN组为2.3%。结论:端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制脊索瘤细胞的增殖,且具有促凋亡作用。     

hTERT反义寡核苷酸对脊索瘤细胞周期及增殖的影响

目的：探讨hTERT反义寡核苷酸（ASODN）抑制CM-319细胞端粒酶活性对脊索瘤细胞的细胞周期及增殖的影响。方法：用脂质体介导hTERT正义寡核苷酸（SODN）和反义寡核苷酸（ASODN）转染CM-319脊索瘤细胞株72小时后,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果：hTERT的ASODN转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测显示：ASODN组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期,而hTERT的SODN则无此作用。ASODN组细胞凋亡率为16.01%,而hTERT的SODN组为2.3%。结论：端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制脊索瘤细胞的增殖,且具有促凋亡作用。     

Bcl-XL反义寡核苷酸增强食管癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的探讨Bcl -XL反义寡核苷酸(ASODN)在下调Bcl- XL表达、增加食管癌细胞株EC9706对5氟尿嘧啶(5Fu)敏感性中的作用。方法设细胞对照组、空白对照组、无关序列寡核苷酸(N ODN)组、ASODN组、5Fu组及ASODN联合5Fu组,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测EC9706细胞的增殖抑制率;RT PCR和Westernblot检测Bcl- XLmRNA和蛋白表达水平的改变;吖啶橙荧光染色和流式细胞技术定量检测EC9706细胞的凋亡率。结果Bcl -XLASODN联合5Fu治疗组对食管癌细胞增殖的抑制率为71.58%,对Bcl XLmRNA表达抑制率为81.25%,并可显著下调Bcl XL的蛋白表达;凋亡指数为69.5%,凋亡率为(63.32±9.23)%,与细胞对照组、空白对照组、N -ODN组、ASODN组及5Fu组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ASODN联合5Fu可有效抑制食管癌细胞EC9706的增殖,通过ASODN下调Bcl XL表达,可显著增强食管癌细胞对5Fu的敏感性。     

microRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨miRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用TaqMan探针实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测50例食管癌患者中新鲜食管癌组织和其相应癌旁正常组织中miRNA-155的表达情况;使用脂质体LipofectamineTM2000转染EC9706细胞上调miRNA-155的表达,利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测转染后细胞的增殖变化,流式细胞仪检测其细胞凋亡率的变化.结果 食管癌组织中miRNA-155的表达水平明显低于与其相应的癌旁正常组织(P=0.000);转染miRNA-155后,miRNA-155转染组EC9706细胞中miRNA-155的表达水平高于对照组和NC组(P﹤0.05);细胞的增殖明显受到抑制,且细胞的凋亡率明显升高.结论 miRNA-155在食管癌组织中呈低表达,上调其表达能够明显抑制食管癌EC9706细胞增殖和诱导其凋亡.     

生存素反义寡核苷酸促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡

目的:探讨生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)对顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)诱导骨肉瘤细胞凋亡的促进作用。方法:通过合成靶向survivin的ASODN转染骨肉瘤OS732细胞并与DDP联合作用,同时设空白对照组、正义(SODN)组及DDP组进行比较。采用RTPCR、免疫细胞化学法检测各组细胞survivinmRNA和蛋白表达状态,流式细胞仪(flowcytometry,FCM)、吖啶橙/溴化乙锭(acridineorange/ethidiumbromide,AO/EB)染色法检测各组细胞凋亡水平和形态,MTT法检测细胞生长抑制情况。结果:与空白对照组、SODN组及DDP组相比,ASODN转染组细胞survivinmRNA及蛋白表达明显减弱,细胞凋亡水平较空白对照组、SODN组相应提高,细胞萎缩、染色质浓缩呈典型凋亡改变,细胞生长相对受抑;上述指标在ASODN+DDP组变化更为明显,其细胞凋亡指数(apoptoticindex,AI)和细胞生长抑制率(inhibitionratio,IR,61.36%)明显高于各单“药”组(SODN组6.81%、ASODN组31.82%和DDP组41.35%)及SODN+DDP组(45.45%),P<0.05。结论:ASODN能够特异性封闭骨肉瘤OS732细胞中survivin基因表达,使其功能相应受抑,增加细胞对DDP敏感性,进而增进DDP诱导骨肉瘤细胞凋亡效应。     

利用siRNA抑制食管癌VEGF-C的表达

目的 利用siRNA抑制人食管癌EC9706细胞中VEGF-C基因的表达。方法 针对VEGF-C mRNA设计了3条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染食管癌EC9706细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR和原位杂交技术分析siRNA对细胞中VEGF-C mRNA的降解作用;免疫组织化学法分析细胞中VEGF-C蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,免疫组织化学法检测瘤组织中VEGF-C的表达。结果 siRNA能明显降低食管癌EC9706细胞中VEGF-C mRNA和蛋白的表达,稳定转染的3个siRNA组细胞仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和无阳性条带,与无关序列组和正常EC9706细胞组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）;裸鼠体内的成瘤实验,3个siRNA转染组瘤组织中VEGF-C蛋白的表达也明显减少,与正常EC9706组无关序列组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 靶向VEGF-C mRNA的siRNA能在体内外有效抑制VEGF-C的表达,可用于食管癌的基因治疗。     

siRNA抑制食管癌EC9706细胞CXCR4基因表达的实验

目的运用RNAi技术沉默食管癌EC9706细胞CXCR4（chemokine receptor4）基因表达,观察其对肿瘤细胞的生长和转移影响。方法设计CXCR4 基因为靶向的siRNA ,构建siRNA表达载体,通过脂质体将siRNA表达载体转入EC9706细胞。荧光定量PCR法检测细胞CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞周期; MTT法检测细胞侵袭和增殖的情况。结果构建出CXCR4 基因为靶向的siRNA表达载体pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1和pRNAT-U6.2/Lenti -siCX2;荧光定量PCR结果显示,转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1的EC9706细胞和转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX2的EC9706细胞与对照组相比CXCR4 mRNA的表达水平明显降低（P＜0.01）;细胞生长速度较对照组明显减慢（P＜0.01）;流式细胞仪检测结果显示：转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1的EC9706S期细胞比例低于对照组(P＜0.05)。结论沉默CXCR4基因表达对食管癌EC9706细胞的生长和侵袭、转移有明显的抑制作用。     

Silencing of PDK1 Gene Expression by RNA Interference Suppresses Growth of Esophageal Cancer

The current study was conducted to explore the inhibitory effects of a small interfering RNA (siRNA) on3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) expression in esophageal cancer 9706 (EC9706) cells andthe influence on their biological behavior. After transfection of a synthesized PDK1 siRNA, PDK1 mRNA andprotein expression and the phosphorylation level of the downstream Akt protein were assessed using RT-PCRand Western blot analysis. Proliferation, apoptosis, cell invasion and in vivo tumor formation capacity werealso investigated using MTT, flow cytometry, Transwell invasion trials, and nude mouse tumor transplantion,respectively. PDK1 siRNA effectively suppressed PDK1 mRNA and protein expression, and down-regulated thephosphorylation level of the Akt protein in the EC9706 cells (P < 0.05). It also inhibited cell proliferation andinvasion, and promoted apoptosis; such effects were particularly obvious at 48 h and 72 h after transfection (P< 0.05). Growth of transplanted tumors was inhibited in nude mice, with decreased PDK1 expression in tumortissues. PDK1 may be closely correlated with proliferation, apoptosis and invasion of esophageal cancer cellsand thus may serve as an effective target for gene therapy.     

TSA联合基因工程腺病毒H101治疗食管癌皮下移植瘤的研究

目的 研究曲古霉素A(TSA)对基因工程腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,探讨HDAC抑制剂在腺病毒载体基因治疗中应用的可能性和作用机制.方法1)先成瘤后治疗组,构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长至肉眼可见的肿块(约8mm ×7mm)后分组.TSA治疗组:每只每次瘤内注射1.0 μmol/L TSA;...     

反义Stathmin基因对胃癌细胞生长影响的观察

目的探讨反义Stathmin基因的核酸（antisense of stathmin ologodeoxynucleotides,ASODN）对人胃癌细胞系生长的影响及对裸鼠体内肿瘤生长的作用。方法免疫组化检测2010-01-2013-06山东省千佛山医院40例胃癌标本中癌组织及癌旁组织中Stathmin的表达;以人胃癌MCG803细胞系为靶细胞,分为ASODN转染细胞组、SODN转染组及未转染组3组,ASODN为阻断剂,观察ASODN对胃癌细胞的增殖的影响;40只腹腔种植胃癌细胞的裸鼠随机分为2组,观察转染ASODN在裸鼠体内对肿瘤生长的影响。结果Stathmin在胃癌组织中的阳性表达率为77.5%（32/40）,显著高于癌旁组织的32.5%（13/40）,差异有统计学意义,P〈0.001;未转染组及SODN转染组胃癌细胞倍增时间（20h）明显短于ASODN转染组（27h）;随时间进展,ASODN转染组细胞增殖能力均受抑制,差异有统计学意义,P〈0.001;转染ASODN胃癌细胞裸鼠的肿瘤组织体积平为（2.98±0.12）mm^3,小于未转染ASODN组肿瘤组织（7.61±0.21）mm^3,P=0.036。结论 ASODN对胃癌细胞的生长有抑制的作用,有望成为胃癌治疗的新靶点,以提高胃癌患者的生存时间。     

全反式维甲酸诱导荷瘤裸鼠EC9706食管癌细胞凋亡的机制

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导荷瘤裸鼠EC9706食管癌细胞凋亡的作用机制.方法 将食管癌EC9706细胞接种于裸鼠,成瘤后将裸鼠分为ATRA作用组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)作用组、联合用药组和空白对照组,每组10只,腹腔内连续给药10 d后处死裸鼠.采用原位末端标记(TUNEL)法,检测各组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡情况.采用免疫组化SP法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测caspase-3和survivin蛋白及mRNA的表达水平.结果 ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组的细胞凋亡率分别为44.3%、39.7%和91.0%,均明显高于空白对照组(0.7%,均P＜0.01).空白对照组caspase-3蛋白表达水平为46.12±0.33,caspase-3 mRNA的相对表达量为0.14±0.03,均显著低于ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组(P＜0.05).空白对照组survivin蛋白表达水平为96.07±0.13,survivin mRNA的相对表达量为0.84±0.04,均显著高于ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组(均P＜0.05).ATRA作用组与5-Fu作用组的细胞凋亡率、caspase-3和survivin蛋白及mRNA的表达差异均无统计学意义(均P＞0.05),但单药组与联合用药组的差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 ATRA可诱导荷瘤裸鼠EC9706细胞产生凋亡,其作用机制与下调survivin蛋白和mRNA的表达以及上调caspase-3蛋白和mRNA的表达有关.     

脂质体-c-erbB-2反义寡核苷酸转染对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的抑制作用研究

目的　探讨经脂质体—硫代磷酸化修饰的c erbB 2反义寡脱氧核苷酸 (ASODN )作用后的卵巢上皮癌细胞株SKOV3 在裸鼠皮下的成瘤能力。方法　利用脂质体将经硫代磷酸化修饰的寡核苷酸导入SKOV3 细胞内 ,然后将这种被转染的细胞接种于裸鼠皮下 ,观察肿瘤体积的变化 ,并计算抑瘤率。结果　经脂质体 c erbB 2ASODN作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低 ,最大抑瘤率达 4 0 .0 %(P <0 .0 5 )。首次出现目检可见肿瘤的平均时间延长为 9.6天 (P <0 .0 5 )。结论　c erbB 2癌基因的反义调控能降低卵巢上皮癌细胞的成瘤能力 ,抑制肿瘤生长 ,在卵巢上皮癌的基因治疗中有一定价值。     

Effects of CXCR4 gene silencing by lentivirus shRNA on proliferation of the EC9706 human esophageal carcinoma cell line

CXCL12/CXCR4 has been studied as an important biomarker for many human malignancies, but studies are limited for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). In this study, an effective RNAi sequence targeting the CXCR4 gene was selected, a lentiviral shRNA vector was constructed to specifically silence CXCR4 expression in the EC9706 ESCC cell line, and the effects of CXCR4 silencing on cell growth in vitro and tumour growth in nude mice were then evaluated. The expression of CXCR4 in EC9706 was significantly downregulated after transfection with a lentiviral shRNA vector. The expression of the apoptosis-related gene Bcl-2 was decreased. In addition, after CXCR4 inhibition, cell growth was considerably inhibited, increased apoptosis in the EC9706 cells was found, the G₀/G₁ percentage was significantly increased, and the number of cells in S phase was reduced. Moreover, tumour growth in nude mice was inhibited. In conclusion, the downregulation of CXCR4 expression by transfection with a lentiviral shRNA vector in ESCC cells could inhibit tumour proliferation. Our data may provide an avenue for finding new ESCC treatments.     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对体外及裸鼠体内前列腺癌细胞PC3生物学特性影响的研究

 目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸对前列腺癌细胞PC3在体外和裸鼠体内生长特性的影响,以及局部注射反义寡核苷酸治疗裸鼠皮下移植肿瘤的疗效。方法　采用Oligofectamine携带VEGF反义寡核苷酸转染前列腺癌细胞PC3,实验分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组和对照组。软琼脂糖凝胶实验和细胞侵袭实验检测转染反义寡核苷酸的肿瘤细胞成瘤性和侵袭性。裸鼠成瘤实验观察VEGF反义寡核苷酸对体内PC3细胞增殖的影响。建立裸鼠前列腺癌种植瘤模型,局部注射VEGF反义核酸治疗,测定体内抑瘤率。结果　对照组、正义寡核苷酸组和反义寡核苷酸组的PC3细胞每组阳性克隆数分别为53.67±5.86、52.33±6.43和26±4.58（F＝13.73,P＜0.01）,反义组体外形成克隆数显著减少;三组细胞侵袭至下室的细胞数分别为45.60±5.53、42.35±6.21和18.37±3.52（F＝14.18,P＜0.01）;转染VEGF反义核酸的细胞移植瘤生长较慢,接种28 d后三组的肿瘤体积分别为（1330.32±81.38）、（1267.64±120.26）和（641.83±58.34）mm3（F＝17.26,P＜0.01）;局部注射治疗4周后,三组肿瘤质量分别为（1.25±0.08）g、（1.17±0.06）g和（0.41±0.05）g,与对照组比较,正义组和反义组肿瘤抑制率分别为6.4 %和67.2 %,差异有统计学意义（χ2＝17.72,P＜0.005）。结论　VEGF反义寡核苷酸可以抑制前列腺癌细胞PC3 VEGF的表达,进而促进细胞凋亡,降低其成瘤性,抑制侵袭能力。转染VEGF反义寡核苷酸的前列腺癌细胞PC3移植瘤在裸鼠体内生长受抑制,局部注射反义核酸可显著抑制移植瘤的生长。