人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA隆至原核表达载体pET30a（＋）,经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及单克隆抗体制备

目的构建重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的原核表达质粒,制备重组人Lp-PLA2,并通过免疫诱导获得人Lp-PLA2的单克隆抗体。方法以人cDNA文库为模板,通过PCR的方法获得PLA2G7基因的编码区序列,并与原核表达载体pET32a进行连接,构建原核表达质粒,转化大肠杆菌Rostta(DE3)。通过在30℃0.2mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导蛋白表达,经过纯化获得重组人Lp-PLA2;免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体;并通过酶联免疫吸附试验法测定效价,检测抗体特异性。结果通过NotⅠ和SalⅠ双酶切及测序证实原核表达质粒构建成功;经纯化得到47×103左右的蛋白,与Lp-PLA2抗体进行蛋白免疫印迹法杂交呈阳性,表明已得到重组人Lp-PLA2。通过对小鼠免疫,最终获得单克隆抗体,效价为1∶2×106,与纤维蛋白原、C-反应蛋白无交叉反应。结论成功获得重组人Lp-PLA2,并制备得到了效价较高的单克隆抗体,为后续Lp-PLA2检测试剂盒的开发奠定了基础。     

人乙酰肝素酶全长编码cDNA的克隆

目的 克隆乙酰肝素酶(HPA)全长编码cDNA并构建其真核表达载体.方法 培养HepG2细胞后,收集细胞,提取HepG2细胞总mRNA,反转录合成cDNA.以cDNA作为模板通过PCR法扩增HPA蛋白全长编码cDNA;构建真核表达载体.结果 所获得的乙酰肝素酶cDNA序列共1632 bp,与已报道的人乙酰肝素酶编码基因全长cDNA序列一致,并构建了以pcDNA3.1(+)为载体的真核表达质粒.结论 本实验克隆出了人乙酰肝素酶编码cDNA序列,并成功构建了真核表达载体.     

人神经元特异性烯醇化酶基因克隆及单克隆抗体的制备与鉴定

目的研究建立克隆人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因制备鼠抗人NSE单克隆抗体方法。方法用NSE特异引物，通过逆转录多聚酶链式反应从人肺癌细胞株A549中扩增NSE基因，构建重组质粒pGEM-T-NSE，并测序鉴定NSE基因序列。再将NSE基因定向克隆于原核高效表达载体pMS-31b，当表达MS2-NSE融合蛋白后，免疫BALB／C小鼠。并用常规杂交瘤技术，制备鼠抗人NSE单克隆抗体(NSE McAb)。最后，采用免疫细胞化学(ICC)技术检测NSE在肿瘤细胞株中的表达。结果克隆出全长1305bp的NSE基因，其表达的MS2-NSE融合蛋白为57000，表达量1．42mg／L。获得2株能稳定分泌抗NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经检测其分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a。ICC检测证明所得NSE McAb能检测到肿瘤细胞中NSE的表达。结论成功克隆了NSE基因，并获得鼠抗人NSE McAb，为深入研究NSE基因的表达提供了有力的工具。     

乙酰肝素酶蛋白表达与肝癌侵袭转移关系的研究

乙酰肝素酶（heparanase,HPSE）是一种葡糖苷酸内切酶,能特异性降解硫酸肝素多糖的硫酸肝素侧链,破坏细胞外基质和基底膜,乙酰肝素酶与肿瘤血管形成、侵袭转移密切相关。我们采用免疫组织化学法检测 HPSE 蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达,探讨 HPSE 蛋白与肝癌临床病理特征的关系。     

神经元特异烯醇化酶单克隆抗体的制备

用ＮＳＥ粗制品免疫雌性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，经免疫小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０的融合，ＥＬＩＳＡ法筛选，建立了四株持续分泌抗ＮＳＥ单抗的杂交瘤细胞。免疫沉淀法，单抗亲和柱纯化抗原鉴定等方法证实所分泌单抗对ＮＳＥ具有良好的特异性，注入同系小鼠腹腔可诱生含较高效价的抗ＮＳＥ的腹水。这四株细胞分泌ＩｇＧ１亚类抗体、且检查其染色体数目均大于９０条。     

人乳头瘤病毒16型和18型E6蛋白单抗制备及其鉴定

目的开发能够用于检测HPV16、HPV18感染的诊断技术,原核表达HPV16E6、18E6重组蛋白,制备相应的单克隆抗体,为建立HPV的诊断方法提供物质基础。方法BL21-PET28a-16E6、BL21-PET28a-18E6工程菌株由该实验室前期构建,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HPV16E6、18E6重组蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、蛋白质免疫印迹法(Western blot)对HPV16E6、18E6重组蛋白进行鉴定,His亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。以纯化的重组蛋白HPV16E6、18E6为免疫原免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备相应单克隆抗体,间接法测抗体,酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表达并纯化获得了HPV16E6、18E6蛋白,杂交瘤技术获得HPV16E6-2-G9、HPV16E6-2-F2、HPV18E6-3-H1杂交瘤细胞株,Western bolt结果显示,其分泌抗体可分别与HPV16E6、18E6特异性结合,用HPV16E6-2-G9、HPV18E6-3-H1制备的腹腔积液效价分别可达106。结论成功制备抗HPV16E6、18E6单克隆抗体,该抗体效价高,特异度好,为建立血清学诊断方法打下了基础。     

抗胆固醇酯转运蛋白单克隆抗体的制备及其应用

目的　自行制备胆固醇酯转运蛋白 (CETP)单克隆抗体 (McAb) ,建立人血清CETP的酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,并调查中国人群CETP参考值。方法　应用杂交瘤技术制备CETPMcAb。用棋盘试验确定ELISA法的反应条件 ;进行灵敏度、精密度、回收率、特异性试验。结果　制备出一株特异性好、反应性强的CETPMcAb。筛选出ELISA法最佳反应条件 ,样品稀释2 0 0 0倍 ,可检测 0 2 8～ 4 5 2mg/L的血清CETP水平 ;平均批内CV 4 9% ,平均批间CV 10 2 % ;平均回收率为 92 5 %～ 97 2 % ;特异性高。检测结果同国外试验室ELISA法高度相关。 112 8例参考人群血清CETP浓度为 1 84± 1 5 5mg/L ,女性高于男性 ,随着年龄增高 ,CETP浓度降低。冠心病患者CETP浓度为 2 66± 2 0 8mg/L ,较相应对照组显著升高 (P <0 0 1)。结论　该法具有方便、快速、准确、特异等优点 ,对了解CETP在动脉粥样硬化发生中的作用有着十分重要的意义。     

乙酰肝素酶在脂肪肝中的表达

目的观察乙酰肝素酶在脂肪肝中的表达，以探讨其在脂肪肝中的作用。方法采用酒精灌胃造脂肪肝的模型，运用免疫组化的方法检测乙酰肝素酶。结果在脂肪肝中，乙酰肝素酶的表达明显增强，且与甘油三酯的水平高低有关。结论氧化应激、缺氧诱导乙酰肝素酶的表达，且乙酰肝素酶参与脂肪肝的形成。     

乙酰肝素酶在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨胰腺癌组织中乙酰肝素酶（HPSE）的表达及其临床意义。方法应用免疫组化SABC法检测45例胰腺癌组织、20例癌旁组织、20例正常胰腺组织中HPSE的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系。结果胰腺癌组织中HPSE的阳性表达率明显高于癌旁及正常胰腺组织（x^2=22．35、29．79,P〈0．05）。淋巴结转移组HPSE蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移组（x^2=4．60,P〈0．05）。Ⅲ＋Ⅳ期组HPSE蛋白阳性表达率高于Ⅰ＋Ⅱ期组（x^2=6．91,P〈0．05）。结论在胰腺癌组织中HPSE高表达,且与肿瘤的浸润、转移有关。HPSE可以作为判断胰腺癌浸润、转移的参考指标之一。     

抗人和肽素单克隆抗体的研制

目的制备抗人和肽素单克隆抗体并完成鉴定。方法合成人和肽素C端及N端氨基酸片段并耦联钥孔戚血蓝蛋白(KLH)作为抗原,分别免疫BALB/c小鼠,利用经典杂交瘤技术筛选出分泌抗人和肽素抗体的单克隆细胞株,动物体内诱生法收集腹水,葡萄球菌蛋白A亲和层析柱纯化腹水中的单克隆抗体(单抗),完成抗体亚类鉴定,用间接ELISA鉴定其活性,初步应用于免疫细胞化学检测。结果获得了3株特异性抗人和肽素单抗2h7、5b10及5e7,均属于IgG1亚类,2h7针对的抗原表位在和肽素C端,而5b10及5e7针对的抗原表位在和肽素N端。间接ELISA检测证实3株单抗均特异性识别人和肽素,其中2h7和5b10可应用于免疫细胞化学分析。结论成功制备出抗人和肽素单抗,能特异识别和肽素C端和N端,可应用于细胞免疫化学检测,为人和肽素的进一步研究提供依据。     

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的：探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白的原核表达方法，并制备鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体为抗铜绿假单胞菌感染提供了研究基础。方法：根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列合成重组质粒pET-21a-VgrG1a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠源多克隆抗体，并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞，再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定产出特异性抗体的细胞株。在公司测序后获得单克隆抗体的序列信息，并设计出含有此抗体的质粒，转染Expi293细胞，制备人源化单克隆抗体。结果：结果显示，实验成功构建了VgrG1a重组质粒，经探索在最佳表达诱导条件下（温度16℃，IPTG浓度0.5mM，诱导时间16小时），表达得到了重组蛋白VgrG1a，SDS-PAGE显示72kDa处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高，并且与目的蛋白能够能特异性的识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论：以上结果表明，该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

人5型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人5型腺病毒(HAdV5)六邻体(Hexon)蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化的Hexon蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗HAdV5的Hexon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。纯化获得单克隆抗体,使用ELISA和Western blot鉴定单克隆抗体的敏感性和特异性。结果 ELISA和Western blot结果表明这4株单克隆抗体与HAdV5的Hexon蛋白可以特异性结合。单克隆抗体株4A9-HRP标记和8D6建立的ELISA夹心法具备较高灵敏度和特异性。结论获得4株抗HAdV5的Hexon蛋白的单克隆抗体,为HAdV5相关的疫苗研制和HAdV5感染性疾病的早期快速诊断奠定了基础。     

A new murine monoclonal antibody against Kx protein

Mice immunized with a synthetic peptide located on an intracellular segment of the polytopic Kx protein (37 kDa) from human red blood cells (RBCs) produced a monoclonal antibody called C7B8. As expected, this antibody did not agglutinate common RBCs but reacted with permeabilized cells in flow cytometry. C7B8 recognizes the Kx protein on Western blots. Cross-reactivity of C7B8 with human calpain of human muscle extracts was demonstrated by Western blot analysis. This cross-reactivity precludes the use of C7B8 for Kx tissue distribution studies, but immobilized C7B8 was a convenient tool for purification of the Kell-Kx complex from RBC membrane extract by immunochromatography.     

抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测

目的：制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体并建立外周血巨细胞病毒抗原血症免疫荧光检测方法。方法 CM V AD169感染人胚胎肺成纤维细胞M RC‐5后24、48、72h ,超声波破碎和甲醛灭活制备CM V抗原,以及CMV pp65重组抗原免疫BALB／C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒CM V BriteTM Kit进行比对。结果共有两株杂交瘤细胞产生特异性抗体,克隆名称为13D1‐3和29F1‐1,免疫球蛋白亚型分别是IgG1型和IgG2a型,制备的腹水抗体纯化后仍具有良好的免疫学特性。单克隆抗体13D1‐3与 CM V BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率为88．8％,阴性符合率为98．9％,总符合率为97．3％,Kappa值为0．895,吻合度较高。结论成功制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,建立以13D1‐3单克隆抗体为基础的检测外周血巨细胞病毒抗原血症方法,与CM V BriteTM Kit试剂盒比对具有良好的符合性。     

The application of monoclonal antibodies in cancer diagnosis

Cancer becomes the second leading cause of death in the world. An effective strategy for early diagnosis of the disease is key to reduce the mortality and morbidity. Development of effective monoclonal antibody (mAb)-based assays or diagnostic imaging techniques for detection of antigens and small molecules that are released from cancerous cells will enhance modern diagnostic medicine of cancer significantly. Although mAb technology is still under development, recent advances in preparation of recombinant antigen and antibody engineering techniques have dramatically enhanced the applications of this technology in cancer diagnosis. Compared with other methods, mAb-based assays may provide spatial, temporal, accurate and quantitative measurement for diagnosis of the disease. This review summarizes the progress of the mAb-based assays in the field of molecular diagnosis of cancer.     

The production and evaluation of two human monoclonal anti-D antibodies

Summary. The passive administration of anti-D immunoglobulin is effective in preventing Rh alloimmunization and therefore preventing haemolytic disease of the newborn. However, diminishing availability and increased demand render an alternative source of anti-D desirable. We report the production of two human monoclonal IgGl antibodies specific for Rhesus antigen D. Data are presented on the serological reactivity of these antibodies and on their ability to promote in vitro biological activity. Antibody derived from both lymphoblastoid cell lines and the hetero-hybrid cell lines were compared for both ESD-1 and ESD-4. The ability of the antibodies to detect rhesus related antigens in animal tissue was also assessed. We present some evidence for altered reactivity of the ESD-4 antibody following fusion of the lymphoblastoid parent line to a murine plasmacytoma.     

抗HCCR单克隆抗体的制备及其鉴定

目的制备抗人宫颈癌癌基因（HCCR）单克隆抗体（mAb）,并进行鉴定。方法以HCCR重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,常规筛选杂交瘤细胞。腹水诱导法制备抗人HCCR单克隆抗体,并经蛋白A亲合层析进行纯化。用Western blot和免疫荧光等方法检测HCCR mAb的特异性。用纯化HCCR蛋白进行包被,建立间接ELISA方法,检测系列稀释的HCCR mAb,确定其灵敏度。结果筛选出2株分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明抗人HCCR抗体能与HCCR蛋白特异性结合,免疫荧光结果显示肝癌HepG2细胞中胞浆和胞膜均呈阳性染色。间接ELISA方法检测HCCR mAb的灵敏度可达到1μg/L。结论成功制备并鉴定了特异性抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,为进一步深入研究HCCR的生物学特征和临床应用打下基础。     

胶体金标记单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒制备

目的制备单增李斯特菌54001、54002型的单克隆抗体（McAb）,制备胶体金标记单增李斯特菌抗体免疫层析检测试剂板。方法以纯化单增李斯特菌为抗原,免疫Balb／c小鼠,制备单克隆抗体,鉴定其特性,建立并验证胶体金标记单增李斯特菌抗体免疫层析试剂板的检测方法。结果筛选出2株单抗杂交瘤细胞株F5、F9,免疫球蛋白亚类均为IgM。通过选用柠檬酸钠法制备胶体金,测定其最适结合蛋白浓度为28g/ml,制备胶体金标记单增李斯特菌抗体免疫层析检测板。结论为产单核李斯特菌提供了一个方便、快捷、切实有效的检测技术。     

Function-blocking antithrombospondin-1 monoclonal antibodies

BACKGROUND: Thrombospondin-1 (TSP-1) has been implicated in many different processes based in part on inhibitory activities of anti-TSP-1 monoclonal antibodies (mAbs). OBJECTIVE: To map epitopes of 13 anti-TSP-1 mAbs to individual modules or groups of modules spanning TSP-1 and the closely related TSP-2 homolog. RESULTS: The mapping has led to assignment or reassignment of the epitopes of four mAbs, refinement of the epitopes of six mAbs, and confirmation of the epitopes of the remaining three mAbs. ESTs10, P12, and MA-II map to the N-terminal domain; 5G11, TSP127.6, and ESTs12 to the third properdin module; C6.7, HB8432, and P10 to epidermal growth factor (EGF)-like modules 1 and/or 2; and A6.1, mAb133, MA-I, and D4.6 to the calcium-binding wire module. A6.1, which recognizes a region of the wire that is identical in mouse and human TSP-1, reacts with TSP-1 from both species, and also reacts weakly with human TSP-2. Two other mouse antihuman TSP-1 mAbs, A4.1 and D4.6, also react with mouse TSP-1. CONCLUSIONS: Consideration of previous literature and mapping of epitopes of inhibitory mAbs suggest that biological activities are present throughout TSP-1, including the EGF-like modules that have not been implicated in the past. Because the epitopes for 10 of the antibodies likely are within 18 nm of one another in calcium-replete TSP-1, some of the inhibitory effects may result from steric hindrance. Such seems to be the case for mAb133, which binds the calcium-binding wire but is still able to interfere with the activation of latent TGF-beta by the properdin modules.