EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备

目的设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用.方法cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全 EBV基因组探针,它们的长度被定在300～600 mer并且具有高度特异性.从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和 RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体.所有的探针被测序鉴定.结果除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRFl基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆.结论EBV cDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础.     

神经生长因子cDNA探针的制备及应用

人重组βＮＧＦ／ｐＵＣ１９，经ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨⅠ双酶切后，获βＮＧＦ ＤＮＡ片段。用随机引物标记法进行Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记，在小鼠颌下腺原位杂交检测ＮＧＦｍＲＮＡ显示出很高的特异性，该探针的制备为ＮＧＦ在神经及非神经系统的研究提供新的方法。     

EBV全基因组芯片的制备及应用

目的 鼻咽癌高发于中国南方,是一种恶性度较高的肿瘤,与EB病毒(EBV)关系非常密切.本研究利用前期已经设计和克隆好的EBV已知和预测的编码基因作为eDNA探针,构建EBV芯片,用于检测鼻咽癌组织中的EBV基因表达.方法 85个EBV基因探针通过一对设计于T/A克隆载体多克隆两端的引物进行PCR扩增.产物纯化后,与8000个人基因打印到同一张玻片上,建立EBV与人基因的检测芯片.随后用于检测鼻咽癌组织与正常鼻咽组织之间的基因表达差异,观测检测效果,以确定是否可以临床应用.结果 在人的基因表达谱中,我们成功检测了大量的人基因表达.而在EBV阵列中,我们虽然得到了一些EBV基因表达的信号,但这些信号都非常微弱,没有明显可见的荧光,其表达强度无法与人的基因表达信号强度相比.结论 虽然我们成功地构建了EBV芯片,但由于可能受到基因芯片检测的敏感性以及EBV基因在鼻咽癌中表达量的限制,不能用于临床检测,需要进一步改进研究方法.     

用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针

为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系 ,本文采用降落PCR技术、分子克隆技术和Fas特异性引物 ,将从人肝细胞cDNA文库中扩增的FascDNA插入T -easyvector中 ,转染JM10 9,经耐药性和lacZ插入失活筛选 ,快速细胞裂解法、限制性内切酶酶切片段和PCR扩增试验分析鉴定 ,确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见方法 ,标记扩增、分离和纯化的FascDNA ,经斑点免疫实验证实获高滴度Dig -FascDNA探针     

逆转录法制备地高辛标记的食管癌cDNA探针

目的：制备食管癌cDNA探针用于Reverse Northern Blot筛选差异基因片段。方法：提取食管癌组织总RNA,通过逆转录反应,用地高辛标记为cDNA探针。结果;所制备的探针灵敏度高达0．01ng/L.结论：用该方法制备cDNA探针快速、经济,所需模板RNA量少,可用于大规模初筛差异基因片段的研究。     

地高辛标记人 TGF β1cDNA 探针的制备

用ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ两种限制性内切酶在同一反应体系中对ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ重组质粒联合酶切获得１．３Ｋｂ的酶切片段作为裸探针,比以往文献中报道的长度缩短约７００ｂｐ,经地高辛标记获得较高的标记效率。     

地高辛标记的金黄地鼠RPL30cDNA探针的制备和应用

目的制备地高辛标记的核糖体蛋白RPL30cDNA探针并用其研究RPL30在神经管发育过程中的表达状况。方法利用分部分排除技术（SSS法）从金黄地鼠神经管cDNA文库中逐级筛选得到RPL30cDNA的全长序列；随机引物法制备地高辛标记RPL30cDNA探针，点杂交法检测探针的灵敏度；Northern杂交检测神经管发育过程中RPL30mRNA的表达状况。结果本研究从构建的神经管cDNA文库中得到RPL30cDNA片段，全长535bp；制备探针的浓度达到50mg／L；Northern杂交检测发现E8d～E12d神经管中RPL30mRNA的表达均处于较高水平。结论该研究结果为进一步探讨RPL30与神经管发育和神经管畸形发生之间的关系奠定基础。     

BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及其cDNA探针的制备

目的 提取、克隆BALB／c小鼠乳糖酶基因Lac,了解其序列及所编码蛋白的属性,并制备Lac cDAN探针,为进一步研究乳糖不耐受奠定基础。方法 取4周龄BALB／c小鼠小肠组织,用Trizol试剂盒提取总RNA,经RT—PCR、梯度PCR获取Lac cDNA。测序鉴定后将序列提交NCBI GenBank,同时利用生物信息学,对其编码产物进行预测。探针的制备采用随机引物法以地高辛标记。结果 所获得的Lac cDNA编码区有912bp,编码303个氨基酸残基,在其二级结构中存在一个糖苷键水解酶基序,C-末端有一疏水螺旋区。标记后的探针经检测,灵敏度达到1pg／μl。结论 所获得的Lac基因经鉴定确为乳糖酶基因,由它编码的蛋白产物是乳糖酶。标记的探针灵敏度很高,可以用于原位杂交实验。     

EBV全基因组基因芯片构建与初步验证

目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)高发于中国南方,是一种恶性度较高的肿瘤,与EB病毒关系非常密切。本研究利用前期已经设计和克隆好的EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针,用于研制EBV微阵列。利用能高产EBV病毒颗粒的B95-8细胞作为检测对象,观测基因芯片检测的效果,已确定是否将来用于临床检测。方法:87个EBV基因探针通过一对设计于载体多克隆两端的引物进行PCR扩增。产物纯化后,探针被打印在Corning玻片上。通过与Cy3标记的B95-8细胞cDNA进行杂交反应,检测B95-8细胞内EBV基因表达。RT-PCR验证检测。结果:利用构建的EBV芯片,成功地在B95-8细胞中检测到了几乎所有的EBV潜伏基因的表达,随后RT-PCR验证了该结果。结论:我们成功地构建了EBV微阵列,且设计的EBV探针检测是有效的。但EBV微阵列是否可以用于鼻咽癌标本的检测还有待进一步证实。     

Epstein-Barr病毒舆其相网疾病研究造展

长期以来，Epstein-Barr病毒（简称EB病毒）一直被认为是人类某些严重疾病以及肿瘤的致病因子。它与许多疾病的发生都有着密切的关系，威胁着人类的健康，因而受到医学研究工作者的广泛重视，本文旨在对EBV与其相关疾病的研究进展情况进行初步的总结。     

从人肝细胞文库中克隆Fas cDNA

为获取人FascDNA ,以探索Fas的功能作用 ,本文采用高滴度Dig -FascDNA探针噬菌斑影印杂交筛选技术 ,从人肝细胞cDNA文库 (HL -cDNA)中获得多个FascDNA克隆     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人类白细胞介素2表达型基因重组子pRET—90的构建

应用基因重组技术,将人类白细胞介素2(IL-2)cDNA的440bp限制性内切酶片段(HgiAI-DraI)重组于T_7 promotor质粒pET 3d的Ncol克隆点,构建成表达型重组质粒pRET-90。     

用PCR制备检测丁型肝炎病毒基因芯片的探针

目的：制备诊断丁型肝炎病毒(HDV)cDNA基因芯片探针。方法：针对HDV病毒基因保守区域设计聚合酶链反应(PCR)引物，纯化PCR扩增产物克隆，并测序鉴定。结果：序列分析表明，所扩增的片段均属于HDV特异基因。结论：利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便、实用的方法。     

Chemical synthesis and cloning of human calcitonin (hCT) cDNA

Humancalcitonin(hCT)isanoligo--peptidehormonecontaining32aminoacidresidues(aa)whichisproducedbytheC--parafollicularcellsofthethyroidglandinhumans.Togetherwiththearathyoidichormoneand1,25--dihydroxycholecalciferol,hCTplaysanimportantroleintheregulationofcalciumandphosphatemetabolism.Itstimulatestheimmobilizationofthecalciuminthebonesystem,preventingtheresorptionofthebones.ThehCThasbeenadministeredfortreatmentofpatientssufferingfromvariousdiseaseswherestronghypercalcemiaorboneresorptionoccurs…