MMP-9基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制

目的构建基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌细胞体外侵袭的抑制作用。方法筛选确定的MMP-9基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2shMMP-9慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Southern印迹法检测喉癌细胞MMP-9蛋白表达。Boyden侵袭小室法实验观察转导后的喉癌细胞侵袭能力的变化。结果成功构建MMP-9 shRNA的慢病毒载体LV2shMMP-9,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×10~(10)TU/L。转导MMP-9 siRNA的喉癌细胞MMP-9蛋白表达阴性。MMP-9 siRNA转导后喉癌细胞体外侵袭能力下降。结论成功构建人MMP-9基因RNAi慢病毒载体,MMP-9基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用。     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

RNA干扰介导的PIK3CA基因沉默抑制Hep-2细胞增殖和侵袭力

目的观察RNA干扰介导PIK3CA基因表达沉默对喉鳞状细胞癌（简称喉癌）细胞增殖和侵袭力的影响,探讨PIK3CA基因作为喉癌基因治疗靶标的可行性。方法构建PIK3CA-shRNA的慢病毒表达载体,在脂质体介导下转染人喉癌细胞Hep-2。采用real-time RT-PCR和Western-blot检测PIK3CA基因的表达,MTT法、细胞克隆形成实验、细胞生长曲线检测细胞生长增殖,Boyden小室模型检测细胞的体外侵袭力。结果表达PIK3CA-shRNA的慢病毒载体构建成功;与对照组相比,实验组细胞PIK3CA mRNA和蛋白表达明显下调,分别达75％和70％（P〈0．05）;细胞增殖和侵袭力均受到明显抑制,差异显著（P〈0．05）。结论靶向PIK3CA基因的RNA干扰可抑制喉癌细胞的增殖和侵袭力,PIK3CA有望成为喉癌基因治疗的新的候选基因。     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。 方法 设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。 结果 与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。 结论 成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。     

TFPI-2重组腺病毒抑制喉鳞状细胞癌侵袭的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因转染对喉鳞状细胞癌细胞侵袭的影响.方法:将TFPI-2基因(Ad-TFPI-2)体外转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,运用Western-blot检测Hep-2细胞TFPI-2蛋白表达,运用Boyden小室实验检测Hep-2细胞的侵袭能力的变化,将感染Ad-TFPI-2的Hep-2细胞接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力.结果:经酶切、测序等方法的鉴定证实了Ad-TFPI-2的正确性,病毒滴度为2.8×1013PFU/L,Western-blot结果显示TFPI-2蛋白在实验组Hep-2细胞表达增高,Boyden小室实验显示实验组Hep-2细胞的侵袭能力降低,裸鼠成瘤实验显示实验组Hep-2细胞成瘤能力下降.结论:TFPI-2重组腺病毒能够有效地抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的侵袭能力.     

RNA干扰对喉癌细胞MMP-9基因表达的抑制效应及其与瘤细胞增殖活性和侵袭潜能的相关性

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对喉癌细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9)表达活性的抑制作用及其与瘤细胞增殖和侵袭潜能的相关性.方法 于MMP-9基因编码区选择1对目标序列(A组)及1对非特异性序列(B组)构建小分子干扰RNA(siRNA)表达元件,转染Hep-2喉癌细胞,以未转染的母代细胞作为对照组(C组),RT-PCR法检测MMP-9 mRNA转录活性,蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达活性,细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭潜能.结果 A、B、C组细胞MMP-9mRNA相对表达水平分别为0.51±0.05、0.87±0.09、0.89±0.07,MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.29±0.07、0.595±0.11、0.61±0.10,A组的相对表达水平均明显下降(P<0.05);A、B组细胞侵袭抑制率分别为48.0%和11.5%,组间差异有统计学意义(P<0.05),但细胞增值活性却无明显变化(P>0.05).结论 Hep-2喉癌细胞中存在RNAi现象,MMP-9 siRNA特异性抑制MMP-9基因表达,伴随以细胞侵袭潜能明显减弱.     

表皮生长因子受体为靶向的多肽基因导入系统介导 p21 WAF1对人喉癌的基因治疗

目的：评价靶向性非病毒载体系统介导的p21^WAF1对人喉癌基因治疗的可行性和有效性。方法：利用组建的表皮生长因子受体(EGF-R)介导的多肽基因导入系统与p21^WAF1基因构成基因载体复元物，分别体外转染人喉癌Hep-2细胞，通过荧光显微镜观察和通过转染喉癌细胞生长曲线及流式细胞仪检测等方法观察新的受体介导多肽基因导入系统对外源基因的导入和导入后对人喉癌细胞的抑制作用。结果：荧光显微镜观察到标记基因的表达产物绿色荧光蛋白，转染后48h呈弱阳性，72h呈强阳性；p21^WAF1基因转染后喉癌细胞生长受到明显抑制，第4天抑制率为79％；流式细胞仪检测到p21^WAF1转染的Hep-2细胞发生了明显的凋亡。结论：EGF-R介导的多肽基因导入系统可靶向性地将治疗基因导入Hep-2人喉癌细胞，p21^WAF1基因可明显抑制Hep-2细胞的生长并有效诱导基因凋亡。     

CD44基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建CD44基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并在下咽癌FaDu细胞株上鉴定其沉默效率,为研究目的基因沉默后下咽癌肿瘤细胞致瘤性的改变提供稳定可靠的载体。方法针对目的基因CD44mRNA的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计、合成4个CD44基因特异性小分子干扰iRNA（small interference RNA,siRNA）靶点,将其合成短发卡hRNA（short hairpin RNA,shRNA）并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获取正确克隆。将筛选出的最有效重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其感染下咽癌FaDu细胞株细胞,采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果对LV-CD44-shRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入序列正确,CD44基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度为8E＋8TU/ml。RNA干扰下咽癌FaDu细胞CD44基因后,CD44 mRNA水平显著下降,干扰效率大于70%。结论成功构建了CD44基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因,为CD44基因沉默后下咽癌肿瘤细胞生物学改变的研究打下了较坚实的基础。     

人糖皮质激素受体β与绿色荧光蛋白融合基因共表达慢病毒载体的构建

目的:构建人糖皮质激素受体(GR)β与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体。方法:采用基因重组技术从人胚脑表达文库内获得人GRβcDNA,双酶切法将目的片段克隆入pGC-LV载体中,获得重组载体pGC-FU-GRβ。测序正确的质粒pGC-FU-GRβ通过脂质体Lipofectamine 2000转染293T细胞。通过荧光检测和Western Blot检测鉴定慢病毒表达载体质粒。与辅助包装质粒转染293T细胞,包装后产生病毒液,Real-timePCR法测定其滴度。结果:成功构建人GRβ-GFP重组慢病毒表达载体,转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,Western Blot检测到GRβ-GFP融合蛋白的表达。Real-time PCR测定病毒滴度为2.00E+8TU/ml。结论:成功构建了人GRβ与GFP基因共表达的慢病毒表达载体,为探讨以激素为首选药物的慢性鼻-鼻窦炎等疾病治疗中GRβ与激素治疗敏感及抵抗的关系,提供了稳定的感染细胞载体。     

EGFL7在人脑胶质瘤中的表达及其与微血管密度的关系

目的探讨EGFL7基因在人脑胶质瘤组织中的表达及与肿瘤微血管密度（MVD）的关系。方法收集4 5例人脑胶质瘤石蜡标本,其中低度恶性（Ⅰ～Ⅱ级）2 4例,高度恶性（Ⅲ～Ⅳ级）2 1例,应用免疫组织化学检测EGFL7蛋白的表达情况,应用八因子免疫组化标记肿瘤微血管。分析EGFL7蛋白表达与胶质瘤病理分级及MVD的关系。结果EGFL7在人脑胶质瘤中存在表达,EGFL7蛋白表达主要位于肿瘤细胞及血管内皮细胞的胞浆。其表达与肿瘤的恶性程度（t=4.3 9 9,P＆lt;0.0 1）及MVD（r=0.6 8 4,P＆lt;0.0 1）有明显的相关性;EGFL7在正常人脑组织中无表达。结论人脑胶质瘤存在EGFL7基因的表达,并且与肿瘤恶性程度及MVD具有明显相关性,提示EGFL7在人脑胶质瘤的血管生成中可能发挥重要作用。     

人B7-1 cDNA的克隆及鉴定

［摘要］目的：克隆人B7 1全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据B7 1基因序列设计并合成可扩增B7 1 cDNA的特异性引物，用RT PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增B7 1 cDNA，并克隆至pGEM T载体中，经酶切鉴定后再行序列分析。结果: 逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的889 bp一致; 用M13正、反向引物行序列测定，证实克隆出的序列与GenBank的B7 1 cDNA序列完全一致; 人B7 1全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM T中。结论: 克隆人B7 1全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7 1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。     

miR-15a/16-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建miR-15a/16-1过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定、滴度测定与感染靶细胞。方法：利用PCR法钓取miR-15a/16-1序列片段;将目的基因miR-15a/16-1克隆到慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定并大量抽提;利用脂质体将重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞包装产生慢病毒。收集病毒悬液梯度稀释,感染293T细胞进行病毒滴度检测;将所得慢病毒感染靶细胞。结果：酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为1×10^9 TU/ml,对照组病毒滴度为2×10^9 TU/ml。慢病毒成功感染靶细胞,其转染效率可达到80%左右。结论：成功构建miR-15a/16-1慢病毒表达载体,可获得高效miR-15a/16-1的慢病毒颗粒。     

鼻咽癌EGFL7的表达与肿瘤侵袭转移的关系

目的 观察表皮生长因子样结构域7(EGFL7)在鼻咽癌中的表达,并了解其与微血管密度(MVD)、淋巴管密度(LVD)的相关性,探讨其与鼻咽癌侵袭转移的关系及其可能的机制.方法 采用免疫组化法检测40例鼻咽癌组织(实验组)及20例鼻咽炎(对照组)中的EGFL7的表达;用CD31抗体及D2-40抗体分别检测实验组及对照组的MVD及LVD,并分析EGFL7的表达与肿瘤分级及MVD、LVD三者的相关性.结果 实验组与对照组均有EGFL7的表达,但实验组中EGFL7高表达率高于对照组(P<0.05);实验组中EGFL7的表达与MVD呈正相关,但与LVD相关性不明显;实验组中有淋巴结转移的LVD明显高于无淋巴结转移的(P<0.05);实验组中EGFL7的表达与患者性别、年龄、EB病毒抗体无相关性(P>0.05),与临床分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05).结论 EGFL7并不像VEGF家族对血管、淋巴管均有双重作用,它仅表达于血管内皮细胞及鼻咽癌细胞中.EGFL7与鼻咽癌的生长和侵袭转移关系密切,它可能成为反映鼻咽癌转移及预后的标志物之一.     

干扰hTERT基因慢病毒载体对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用

目的:本课题利用RNA干扰(RNAi)技术,研究短发夹RNA (siRNA)抑制人端粒酶逆转录酶( hTERT)基因表达对鼻咽癌细胞生长的抑制作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA的特异的、含荧光素基因的真核表达载体,包装成慢病毒.实时定量PCR及Western blot分析染细胞hTER...     

慢病毒载体和腺病毒载体转染原代培养的螺旋神经节细胞的比较

目的:比较慢病毒载体和腺病毒载体转染新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGCs)的不同转染特性.方法:体外培养新生大鼠SGCs,适当滴度的慢病毒载体和腺病毒载体转染SGCs,于病毒转染后3 d(培养后6 d)和转染后7 d(培养后10 d),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因(GFP)表达情况和SGCs的细胞形态.行SGC...     

肺炎球菌溶血素基因的克隆

目的应用基因工程技术克隆肺炎球菌溶血素（pneumolysin,Pn）基因,为研制中耳炎蛋白多糖结合疫苗奠定基础.方法根据Walker等肺炎球菌溶血素基因序列（GenBank accession no.X52474）,设计一对各带有一个限制性酶切位点的引物,运用PCR从肺炎球菌的染色体DNA扩增出肺炎球菌溶血素基因.对该PCR产物进行酶切、回收,并将其克隆入表达载体pET-28a,然后转化至大肠杆菌JM109（DE3）宿主细胞中.结果通过常规基因克隆方法和PCR技术,成功构建重组体,酶切鉴定和基因测序证实构建正确.结论利用基因工程技术成功克隆了肺炎球菌溶血素基因.     

鸡耳蜗EFNA2基因RNAi慢病毒载体的构建及其靶基因离体沉默效率

目的构建鸡耳蜗EFNA2基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,在离体培养原代鸡听神经细胞中鉴定其沉默效率。方法针对鸡EFNA2基因序列设计特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点,构建慢病毒pFU-GW-iRNA载体,将筛选所得有效短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体在293T细胞中包装成病毒颗粒,随后将其感染离体培养原代鸡听神经细胞,最后采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率。结果 PCR克隆鉴定及测序结果显示所构建的shRNA慢病毒载体正确无误,包装病毒后的滴度为2.0×109 TU/ml,分别命名为LV-GFP-EFNA2-shRNA-l、LV-GFP-EFNA2-shRNA-2和LV-GFP-EF-NA2-shRNA-3。ShRNA慢病毒颗粒感染目的细胞后,EFNA2基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了76.11%、61.87%和68.44%。结论本研究成功构建了鸡EFNA2基因的RNAi慢病毒表达载体,并能在离体培养的原代鸡听神经细胞中有效沉默靶基因。