Apogossypolone诱导骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究

本研究探讨棉酚衍生物apogossypolone（ApoG2）对多发性骨髓瘤细胞系的抑制增殖、诱导凋亡的作用及其作用机制。应用台盼蓝染色、Hoechst 33258染色、透射电子显微镜检、DNA凝胶电泳法、流式细胞仪分析细胞DNA含量等来判断ApoG2对多发性骨髓瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用。以caspase-3、caspase-9以及BCL-2、BCL—XL分析ApoG2诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制。结果表明：ApoG2对多发性骨髓瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50值在U266细胞和Wusl细胞（48小时）分别为0．1、0．2μmol／L。ApoG2可以诱导骨髓瘤细胞凋亡且呈时间和剂量依赖性。ApoG2可以使骨髓瘤细胞周期停止在G2期,U266细胞G2期比例从9．7％增至19．6％。Wusl细胞从9．8％增至31．7％。ApoG2能导致U266、Wusl细胞caspase-9、caspase-3活性增高。U266细胞和Wusl细胞经ApoG2 25μmoL／L作用24小时后,BCL—XL表达分别下降（7．3±1．4）％和（11．2±6．2）％,Wusl细胞BCL-2表达下降84．4±3．4％。结论：ApoG2对多发性骨髓瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,其作用机制可能和下调BCL-2／BCL—XL表达以及影响细胞周期有关。     

p73基因在甲氨蝶呤诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中的表达

为了探讨甲氨蝶呤（MTX）诱导U937细胞凋亡过程中p73 mRNA的表达变化，用MTX诱导U937细胞凋亡，凋亡指标采用细胞形态学、DNA片段电泳、流式细胞术检测DNA含量及细胞周期的变化等方法；采用半定量反转录PCR（RT－PCR）检测p73 mRNA的表达变化。研究结果显示：MTX可诱导U937细胞凋亡。5μmol/L的MTX作用于U937细胞6小时，可见部分细胞体积缩小，染色质明显浓缩和核碎裂。DNA片段电泳，MTX处理组可见清晰的梯形条带。流式细胞仪检测发现MTX作用于U937细胞，6，8，10小时，细胞的凋亡率分别为5．15％，11．43％和14．7％，并使细胞阻滞在G2／M＋S期，而对照组细胞不发生凋亡。半定量RT－PCR结果显示在U937细胞凋亡前后，p73 mRNA的表达无明显变化。结论提示，在MTX诱导U937细胞凋亡过程中，p73的mRNA水平表达差异无显性。     

FTY720对体外培养MCF-7细胞增殖及凋亡影响的研究

目的探讨FTY720对体外培养MCF-7细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养MCF-7细胞,将其培养液中加入不同浓度的FTY720,继续培养48小时,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;瑞士-姬姆萨染色观察细胞形态变化;流式细胞仪检测FTY720对MCF-7细胞的细胞周期、凋亡率的影响。结果当FTY720浓度为6 400 ng/ml时,体外培养MCF-7细胞的增殖受到明显抑制,抑制率为62.0%（P〈0.05）,而且抑制率呈浓度依赖性;镜下可见细胞出现凋亡的形态;流式细胞仪检测分析显示FTY720可将MCF-7细胞阻滞于G1期,并促进其发生凋亡,凋亡率呈浓度依赖性。结论在体外培养的MCF-7细胞培养液中加入一定浓度的FTY720,能明显抑制该细胞的增殖,调节该细胞周期并诱导其凋亡。     

ASPP1和ASPP2基因高表达对白藜芦醇诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡能力的影响

目的观察ASPP1和ASPP2基因高表达对白藜芦醇诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡能力的影响。方法采用瞬时转染法将pcDNA3／ASPPI和pcDNA3／ASPP2质粒分别转染入乳腺癌细胞MCF-7中,经G418筛选获得高表达ASPP1和ASPP2的MCF7阳性克隆细胞株MCF-7／ASPP1与MCF7／ASPP2。MCF-7、MCF-7／ASPP1与MCF-7／ASPP2细胞分刖加入0、25、50μmol／L 白藜芦醇,采用MTT法检测细胞增殖情况,RT-PCT法检测细胞p53下游基因bax与p21mRNA表达情况;3种细胞分别加入0、100、200μmol／L 白藜芦醇,采用ELISA法检测细胞凋亡率。结果MTT结果显示,25、50μmol／L。白藜芦醇处理后,MCF7／ASPP1与MCF-7／ASPP2细胞存活细胞吸光度值均明显低于MCF-7细胞（P〈0．05）;RTPCR结果显示,25、50μmol／L白藜芦醇处理后,MCF7／ASPPI与MCF-7／ASPP2细胞中Bax和p21mRNA表达水平高于MCF-7细胞;细胞凋亡试验结果显示,100、200μmol／L白藜芦醇处理后,MCF7／ASPP1与MCF-7／ASPP2细胞凋亡细胞吸光度值均明显高于MCF-7细胞（P〈0．05）。结论ASPP1和ASPP2高表达可增强乳腺癌细胞对自藜芦醇的敏感性,且随浓度增高而敏感性增强。     

奥曲肽对肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的：探讨生长抑素类似物奥曲肽（octreotide）对人肝癌细胞SMMC－7721增殖和凋亡的影响。方法：用MTT比色法分析octreotide对肝癌细胞生长的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞周期分布及凋亡相关基因p53,bcl-2的表达。结果：octreotide对人肝癌细胞SMMC－7721的增殖存在抑制作用，与对照相比有明显差别（P＜0．01），这种作用表现出量效及时效关系。流式细胞仪检测发现：octreotide处理组肝癌细胞凋亡率升高，p53基因表达增强，bcl-2表达下降，细胞从G1期进入S期受阻。结论：生长抑素类似物octreotide可抑制肝癌细胞SMMC－7721的增殖，并通过影响细胞的周期分布及凋亡相关基因p53、bcl-2的表达，诱导肝癌细胞的凋亡。     

补骨脂素对乳腺癌耐药细胞株周期和细胞凋亡的影响

目的研究补骨脂素对人乳腺癌多药耐药细胞凋亡和周期的影响。方法用MTT法检测不同浓度的补骨脂素对人乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞株的体外生长抑制作用,并运用流式细胞仪观察细胞凋亡和细胞周期的变化情况,采用RT-PCR检测基因caspase-3、Bcl-2和p53的表达。结果补骨脂素对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞株有明显的抑制作用,其IC50值为(18.785±1.253)μg/ml;作用24 h后,流式细胞仪检测显示细胞周期S期细胞减少,G0/G1期细胞增加(P<0.05),但对早期凋亡细胞影响较小。并上调凋亡基因p53和凋亡执行基因caspase-3(P<0.05),下调抑凋亡基因Bcl-2(P<0.05)。结论补骨脂素对人乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞有明显体外抑制作用,其抑制机制与影响细胞周期及诱导细胞凋亡有关。     

米非司酮增加宫颈癌Caski细胞对顺铂敏感性的研究

目的：探讨米非司酮作用于人宫颈鳞癌Caski细胞后对顺铂敏感性的影响和机制。为临床应用米非司酮治疗宫颈鳞癌提供实验依据。方法：体外培养人宫颈鳞癌Caski细胞，分别或联合应用不同浓度的米非司酮、顺铂处理Caski细胞，采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定米非司酮对Caski细胞增殖活性的作用及其对顺铂敏感性的影响；流式细胞术观察各组细胞凋亡率，并分析细胞周期的变化；异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记流式细胞术（FCM）法测定米非司酮对Caski细胞HPV—E6，p53，Bcl-2，Bax蛋白的表达变化。结果：四甲基偶氮唑蓝比色法结果显示，1．25、2．5mg／L的米非司酮对Caski细胞无显著的抑制作用，其与顺铂合用时能增强顺铂对Caski细胞增殖抑制作用。流式细胞术结果显示，米非司酮（1．25mg／L）对Caski细胞无明显的诱导凋亡作用，但能促进顺铂（1．0、2．0、4．0mg／L）诱导其凋亡。FITC荧光标记FCM法结果显示，米非司酮作用于Caski细胞后，HPV—E6、Bcl-2蛋白表达下调，p53、Bax蛋白表达上调，呈浓度依赖方式。结论：米非司酮能增强顺铂对Caski细胞的增殖抑制和诱导凋亡并对Caski细胞有增殖抑制和化疗增敏作用，与下调HPV16-E6、Bcl-2蛋白表达，上调p53、Bax蛋白表达有关。     

干扰素-α对 U937细胞的促凋亡和抗增殖作用及其机制

为了研究干扰素α对白血病细胞U937细胞的抗增殖作用及其机制，用不同浓度的干扰素仪（500U／L、1000U／L、2000U／L、3000U／L、4000U／L）对U937细胞作用不同时间（0、12、24、36和48小时），用MTT法检测细胞生长抑制率，应用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，RT-PCR方法分析cyclin E mRNA的表达。结果表明：不同浓度的干扰素α处理细胞后，U937细胞生长明显受抑，2000U／L干扰素α能引起细胞凋亡，凋亡率为25．28％-70．54％（P〈0.01），细胞周期相关基因cyclin E mRNA表达降低；干扰素α对U937细胞的抑制率，呈浓度-时间依赖性。结论：干扰素α对U937细胞有明显抗增殖和促凋亡作用，此结果将为干扰素-α在白血病临床治疗方面的应用提供有力的实验证据。     

硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡机制的深入研究

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡的机制。通过细胞计数检测细胞增殖,用流式细胞仪分析细胞周期和活性氧（ROS）水平,Westernblot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,10nmol／L硼替佐米联合50nmol／L阿糖胞苷对U937细胞有明显增殖抑制作用。两药联合协同诱导细胞凋亡。两药联合较单药处理能明显协同增加U937细胞ROS的水平,并能明显上调U937细胞中p-P38,p-JNK表达,下调p-ERK的表达。结论：硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡．其机制可能与R0s的损伤导致JNK、P38通路的激活和ERK的下调,从而影响细胞线粒体途径有关。     

高三尖杉酯碱对K562细胞NF-κB和BCL-2蛋白表达的影响

本研究旨在探讨高三尖杉酯碱（HHT）对K562细胞增殖、凋亡及BCL-2和NF-κB蛋白表达的影响。不同浓度HHT作用K562细胞后用MTT法、流式细胞仪、Western blot等方法分别检测细胞增殖、凋亡、BCL-2及NF-κB蛋白表达水平。结果表明,HHT作用48h,浓度依赖性抑制K562细胞增殖,Ic50为43．89rig／ml。HHT10ng／ml作用48h,K562细胞凋亡率明显增高;细胞周期阻滞于G0／G1期;BCL-2和NF-κB蛋白表达水平明显低于对照组（P〈0．05）。结论：HHT对K562细胞有显著的增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,抑制NF-κB和BCL-2表达可能是其抗CML的机制之一。     

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

[目的]观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响.[方法]针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达.[结果]MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达.[结论]VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞.VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点.     

槲皮素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的抑制作用

目的探讨槲皮素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移能力的影响。方法采用不同浓度槲皮素处理乳腺癌MCF-7细胞,以CCK8法观察乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性,以划痕迁移实验检测槲皮素对MCF-7细胞迁移情况的影响。结果槲皮素处理后乳腺癌MCF-7细胞增殖率明显降低,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05);划痕迁移实验中,随着槲皮素浓度提高,MCF-7迁移率呈递减趋势。结论槲皮素可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并阻断MCF-7细胞迁移。     

人乳癌细胞小球藻CvFad3基因的表达和作用

目的构建真核表达载体pEGFP-C3-n-3,检测小球藻n-3脂肪酸脱氢酶基因CvFad3在人乳癌MCF-7细胞中的表达和作用。方法通过RT-PCR法扩增得到CvFad3基因,将CvFad3基因cDNA插入到真核表达载体pEGFP-C3中,构建重组表达载体pEGFP-C3-n-3,并将其转染入MCF-7细胞中,设空载体pEGFP-C3为对照组。采用RT-PCR检测CvFad3基因的表达,MTT法分析CvFad3基因对MCF-7细胞增殖的影响,气相色谱检测CvFad3基因对MCF-7细胞n-3多不饱和脂肪酸含量的影响。结果构建的重组载体pEGFP-C3-n-3转染入乳癌MCF-7细胞48 h后可检测到CvFad3基因mRNA的条带,而转染pEGFP-C3的MCF-7细胞48 h后检测不到CvFad3基因mRNA的条带。与对照组比较,转染pEGFP-C3-n-3的细胞MTT吸光度明显降低（t=6.039,P〈0.01）;人乳癌细胞MCF-7细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量显著升高。结论重组载体pEGFP-C3-n-3构建成功,CvFad3基因能在MCF-7细胞内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖,增加了细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量。     

Stathmin表达水平与乳腺癌细胞侵袭能力相关性研究

目的 探讨乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中Stathmin基因表达水平与细胞生长、黏附、侵袭等生物学行为之间的关系,为进一步研究乳腺癌转移机制奠定实验基础。方法 应用RT-PCR和Western Blot方法检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中Stathmin基因的表达水平,同时利用细胞增殖试验、细胞黏附试验和细胞侵袭试验检测MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长、黏附、侵袭能力,分析Stathmin表达与细胞的生长、黏附、侵袭能力之间的关系。结果 RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Stathmin基因在MDA-MB-231和MCF-7细胞中表达均高于正常对照细胞(F=10.173,P<0.05),且MDA-MB-231细胞中的表达水平明显高于MCF-7细胞中的表达水平(t=4.562,P<0.05)。而MDA-MB-231细胞在生长、黏附和侵袭能力方面均强于MCF-7细胞(P<0.05)。结论 Stathmin表达水平高的乳腺癌细胞相应的生长、黏附、侵袭能力较强,Stathmin表达水平与细胞侵袭能力密切相关。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

细胞外基质蛋白1对乳腺癌MCF-7细胞和HUVEC生物学功能影响的研究

目的探讨细胞外基质蛋白1(extracellular matrix protein 1,ECM1)在肿瘤中的生物学功能。方法构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体,利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞,药物G418筛选稳定转染细胞株,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,免疫组化检测ECM1蛋白表达。经细胞粘附实验、体外侵袭力实验比较转染前后细胞侵袭力的变化;用MTT比色法分析ECM1对MCF-7和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响。结果成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体,并在MCF-7中稳定表达;转染ECM1后的MCF-7细胞的细胞形态、粘附性、侵袭力和增殖能力无明显变化;MTT比色法检测HUVEC增殖结果示培养液组、空载体转染上清组、ECM1转染上清组HU-VEC D570值分别为0.89±0.06,0.92±0.09和1.39±0.10,各组间差异具有显著统计学意义(p<0.01)。结论ECM1对乳腺癌细胞株MCF-7的生物学特性在体外未见明显影响,但能显著促进血管内皮细胞体外增殖。     

miR-34a调控下游基因FUT8表达介导乳腺癌多药耐药的实验验证

目的探究miR-34a及FUT8的异常表达对乳腺癌多药耐药性的调控机制,明确乳腺癌耐药的诊疗靶点。方法采用Real-time PCR及western blot技术检测MCF-7和MCF-7/ADR中miR-34a和FUT8的表达水平; Real-time PCR技术检测乳腺癌细胞系中miR-34a的转染效率;通过生物信息学方法预测并采用双荧光素酶报告实验验证FUT8与miR-34a之间的靶向关系;特异性调控miR-34a的表达后,分别通过Real-time PCR、western blot以及免疫荧光染色检测转染细胞系中FUT8基因及蛋白质水平变化;采用CCK8实验、免疫荧光实验检测其对MCF-7和MCF-7/ADR细胞增殖、耐药性的调控作用。结果 miR-34a在MCF-7中的表达水平明显高于MCF-7/ADR(P=0.002 6);FUT8基因在MCF-7/ADR中的表达水平明显高于MCF-7(P=0.001 6);FUT8是miR-34a调控乳腺癌耐药性的靶点(P=0.001 9);特异性上调MCF-7/ADR细胞中miR-34a的水平可明显抑制FUT8的表达,并抑制该细胞的多药耐药性及增殖性;而下调MCF-7细胞中miR-34a表达后,FUT8的表达水平明显升高,同时增强了细胞多药耐药及增殖能力。结论 miR-34a通过调控下游基因FUT8的表达介导乳腺癌多药耐药。     

血管内皮生长因子mRNA干扰提高乳腺癌MCF-7细胞对放化疗敏感性的研究

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）mRNA干扰对乳腺癌的治疗意义。方法应用RNA干扰技术,对乳腺癌细胞株MCF-7进行VEGFmRNA干扰,并辅以放、化疗处理。在干扰前后用流式细胞技术、MTr比色法等技术对MCF-7细胞株的细胞周期、凋亡率、抑制率进行检测。结果流式细胞技术显示,转染VEGFsiRNA后MCF-7细胞出现GO—G1阻滞（F=15．237,P=0．017）、凋亡明显增加（F=11．160,P=0．029）;MTr比色法发现,转染前后,紫杉醇对MCF-7细胞的抑制效率明显提高（F=5．256,P=0．036）,作用转染前后MCF-7细胞48hIC50分别为4．76mmol/L、3．29mmoVL;克隆形成率实验中,MCF-7细胞经转染后,克隆形成率出现明显下降,并对紫杉醇及放射治疗具有明显的协同作用（P〈0．05）。结论VEGF基因干扰可以抑制MCF-7细胞的增殖、促进其凋亡．并能提高MCF-7细胞对放化疗的敏感性。     

对MCF-7中不同亚群细胞体外培养的观察

目的：了解人乳腺癌细胞系MCF-7中的不同亚群细胞的体外增殖特性。方法：采用流式细胞技术从MCF-7细胞中分选出不同的细胞亚群,并测定它们在体外的增殖、克隆能力。结果：和CD44＋CD24＋细胞相比,MCF-7中的CD44＋CD24-细胞具有更强的体外克隆能力,而两者的体外增殖能力相近。结论：MCF7中存在乳腺癌干细胞,而CD44＋CD24＋细胞可能是乳腺癌祖细胞。