维甲酸、音猬因子对大鼠脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞分化的影响

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经干细胞进行体外培养,探讨维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导其向运动神经元样细胞分化. 方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光显色检测细胞增殖、分化情况;培养液分组添加Shh、 RA或Shh+RA,观察神经干细胞向运动神经元样细胞的分化情况. 结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示Shh组未检测到胆碱乙酰转移酶阳性细胞,RA组为20.63%, Shh+RA组为66.84%,其差异具统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,Shh、 RA可不同程度地诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

神经干细胞向运动神经元分化及移植的研究进展

神经干细胞是神经科学领域研究的热点之一.在体外适当的条件下神经干细胞可诱导分化成运动神经元,如添加生长因子、相关信号分子、或添加从脊髓源性神经胶质细胞提取的特殊培养液和骨骼肌培养液等,定向诱导分化的神经元移植于脑或脊髓的病变部位将成为运动神经元退行性病变的潜在治疗方法.     

骨形态发生蛋白2对14 d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景：骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。 目的：观察骨形态发生蛋白2在孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。 方法：取孕14 d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24 h后半量换液,加入10 μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。 结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

神经干细胞向神经元诱导和分化的研究

为探讨无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞诱导分化的作用,本研究采用体外分离、培养神经干细胞,传2~3代后,联合应用因子体外诱导神经干细胞分化等方法;通过Ⅱ型微管相关蛋白(MAP2)和S100抗体免疫荧光染色鉴定分化的细胞;图像分析系统测量神经元样细胞的参数;全细胞膜片钳技术记录分化后细胞的钠电流。结果显示:MAP2阳性神经元样细胞所占比例,联合因子组明显高于血清组(P<0.05);胞体面积及周长、突起的长度,联合因子组明显高于血清组和bFGF组(P<0.05)。另外,联合因子组中80%形态似神经元样的细胞能诱发电压依赖性的Na+通道电流。以上结果表明在体外无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞向神经元定向诱导分化是可行的,分化的神经元比例高,且细胞更具有神经电生理特性。     

血清浓度对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响

目的:探讨血清对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响。方法:从新生鼠坐骨神经及臂丛神经分离纯化雪旺细胞,从孕11.5 d大鼠胚胎分离培养神经上皮干细胞,含0%、1%、5%、10%胎牛血清的培养液联合培养雪旺细胞与神经上皮干细胞,收集上清作为条件培养液诱导神经上皮干细胞分化,1周后MAP-2和GFAP细胞免疫化学染色,显微镜下观察统计神经上皮干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例。结果:条件培养液促进神经上皮干细胞存活和分化,分化形成的神经元大体形态与成熟神经元相似,0%、1%、5%、10%血清条件培养液组神经元与星形胶质细胞比例分别为1.53:1、1.13:1、1.03:1、0.75:1。结论:血清影响雪旺细胞诱导神经上皮干细胞向神经元分化,血清浓度增加,神经上皮干细胞分化形成的神经元减少。     

胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景:在神经干细胞移植治疗帕金森病中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题,而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。目的:探讨胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。方法:分离妊娠12d小鼠胚胎腹侧中脑,经胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,离心过滤后机械方法传代培养5~7d的神经球,分组进行诱导分化10~12d,待80%细胞从神经球迁移出来,分化为单细胞时,进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率。结果与结论:神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶和胶原纤维酸性蛋白阳性细胞。胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β在体外能明显提高中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例,胶质源性神经营养因子诱导组、白细胞介素1β诱导组和两者联合应用均较空白对照组比例高,尤其是两者联合应用作用更显著,说明胶质源性神经营养因子、白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。 目的：观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。 方法：无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧+胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧+胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。 结果与结论：在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。 目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。 方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。 结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

骨髓基质细胞对中脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法:采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法,通过显微镜观察神经干细胞的分化状态;使用免疫组织化学技术,分析神经元在神经干细胞后代中所占的比例。结果:(1)骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元;(2)骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论:骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

银杏内酯B对成年大鼠神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨银杏内酯B对神经干细胞分化为神经元的促进作用。方法 采用无血清培养和单克隆实验技术在体外分离培养出大量来源于同一细胞的单细胞克隆球，并将其均匀种植于24孔培养板中，分3组分别加入含银杏内酯B、BDNF和不加任何细胞因子的完全培养液。培养7d和14d后终止，用神经元特异性标记物微管相关蛋白-2(MAP-2)的单克隆抗体进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察和计数．MAP-2标记的阳性细胞并对细胞面积和周长进行图像处理。结果 两个时期银杏内酯组MAP-2阳性细胞数均明显多于单纯对照组而少于BDNF组；分化7d和14d时银杏内酯组MAP-2阳性细胞的面积和周长明显大于单纯对照组，而略小于BDNF组。结论 银杏内酯B亦具有类似BDNF促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

Generation of motor neurons by coculture of retinoic acid-pretreated embryonic stem cells with chicken notochords

Understanding neuroectoderm formation and its subsequent diversification to functional neural subtypes remains elusive. We have shown here for the first time that embryonic stem cells (ESCs) can differentiate into neurons and motor neurons (MNs) by using a coculture embryonic notochord model in vitro. Mouse ESCs were induced to form neural precursors via timed exposure to retinoic acid (RA) using the 4-/4+ RA protocol. These cells were then cocultured with alginate bead-encapsulated notochords isolated from Hamburger and Hamilton stage 6-10 chick embryos. The use of notochord alone was not able to induce neural differentiation from ESCs, and, therefore, notochord does not possess neural inducing activity. Hence, the most successful neuronal cells and MN differentiation was only observed following the coculture of RA-pretreated ESCs with notochord. This resulted in a significantly greater number of cells expressing microtubule-associated protein-2 (MAP2), HB9, choline acetyltransferase (ChAT) and MN-specific genes. While further characterization of these differentiated cells will be essential before transplantation studies commence, these data illustrate the effectiveness of embryonic notochord coculture in providing valuable molecular cues for directed differentiation of ESCs toward an MN lineage.     

Jagged1蛋白抑制神经干细胞向神经元分化的实验

目的：研究Jagged1蛋白对神经干细胞分化的影响。方法：分离小鼠胚胎脑神经干细胞,用Jagged1蛋白、Jagged1蛋白 γ泌肽酶体外诱导神经干细胞分化,观察分化后神经元所占的比例。结果：分离的细胞能持续增殖,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;在Jagged1蛋白的影响下,分化后神经元数量明显减少;γ泌肽酶抑制剂能阻断Jagged1蛋白的诱导作用。结论：培养的细胞为神经干细胞,并表达Notch受体;Jagged1蛋白能抑制干细胞向神经元分化,这种分化作用是通过Notch受体实现的。     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究(英文)

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

小鼠放射状胶质细胞和小脑皮质的发育

目的探讨小鼠小脑皮质发育过程中放射状胶质细胞的分化。方法应用免疫荧光及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)检测技术,标记小鼠胚胎8d至生后180d小脑(57例,分为19组,每组3只)的神经干细胞、放射状胶质细胞、普肯耶细胞及颗粒细胞。结果放射状胶质细胞于胚胎13d的神经上皮出现,尔后该细胞分化为各种神经元和贝格曼胶质细胞,并在小脑皮质层状结构的形成中起着重要作用。结论放射状胶质细胞来源于神经上皮细胞,是神经细胞和神经胶质细胞的前体细胞。在小脑皮质的发育过程中,放射状胶质细胞能分化为普肯耶细胞和颗粒细胞,并为神经细胞的迁移提供路径和支架。     

嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。     

Electrospun nanofibrillar surfaces promote neuronal differentiation and function from human embryonic stem cells

In this study, the impact of randomly oriented electrospun polyamide nanofibrous architecture on neurogenic differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) compared with the lack of nanofibrous features in vitro in a neural-inducing condition was examined. Flow cytometry analysis of hESC-derived neural ectoderm (NE) showed nanofibrous surfaces capable of supporting NE by expression of higher percentages of related markers NESTIN, SOX1, and PAX6 in addition to significantly greater total cell proliferation as shown by Ki67 in the neurogenic condition. After replating hESC-derived NE, the differentiated cells expressed higher neuronal markers (TUJ1 and MAP2) and motor neuron markers (HB9, ISL1, and ChAT) at both the protein and mRNA levels on nanofibers. The presence of developed spread neurites and plausible neurite connections were shown by scanning electron microscopy. Additionally, Na(+) and Ca(2+) currents in differentiated neurons on nanofibers were significantly greater than both control and generated action potentials. Moreover, less duration of inward currents, greater negative resting membrane potential, and enhanced expression and functionality of ionic channel genes were observed in neuronal cells on nanofibers. These results indicated that a nanofibrillar surface along with neurogenic growth factors provided a better environment for hESC neurogenic differentiation and function, which holds great promise in prospective tissue engineering applications.