体外分离骨髓间充质干细胞在诱导条件下的成骨能力特征

背景:利用骨髓间充质干细胞的多方向分化潜能,选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用,可达到修复组织缺损的目的。目的:观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及其在诱导条件下的成骨能力。设计:单一样本实验。单位:右江民族医学院组织胚胎学教研室、右江民族医学院附属医院。材料:实验于2004-06在右江民族医学院组织胚胎学教研室完成。新西兰大白兔,雄性,体质量2.0～2.5kg。方法:抽取兔骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用诱导成骨培养液(50mL/L胎牛血清的Dulbecco改良培养基含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10nmol/L地塞米松,50mg/L维生素C)进行培养,隔日换培养液1次。通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法观测骨髓间充质干细胞的成骨特性。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的成骨特性。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:原代兔骨髓间充质干细胞七八天即可长满,并可稳定传代,传代细胞五六天即可传代。②骨髓间充质干细胞的成骨特性:碱性磷酸酶免疫组化染色可见胞浆中出现大量棕褐色颗粒,对照染色细胞胞浆未见着色;骨连接素、骨桥素免疫组织化学检测可见胞核染成淡蓝色,胞浆内出现大量的棕黄色颗粒,呈明显强阳性,对照染色中胞浆内没有出现黄色颗粒。结论:兔骨髓间充质干细胞用地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠培养液联合诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可在短期内为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

背景：在临床工作中，外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液，并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖，并诱导其向成骨细胞转化。目的：观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计：单一样本实验。单位：天津市天津医院骨科研究所。材料：实验于2004—10／2005—12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×10^2g／L生肌液从生肌象皮膏（由天津市中药饮片厂提供。原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余）提取。方法：将25，8．3，5g／L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞，以不含生肌液的基础培养液为空白对照，以含地塞米松10^-8mol／L，维生素C0．05g／L，β-甘油磷酸钠10mmol／L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周，采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况，采用四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色观察细胞的表达情况，取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量，将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和，计算碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。主要观察指标：培养2，3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。结果：①细胞钙结节观察结果：除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长，胞体先后出现拉长，聚集生长，随后中心细胞增殖、重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成多个散在的细胞结节，钙沉积逐渐出现，最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色：除了基础培养液组外，各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色，空白对照细胞为阴性；除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ⅰ免疫组织化学染色呈阳性，棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶检测结果：条件培养后2，3周，25g／L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定，且高浓度时诱导成骨作用较强。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨分化对血管内皮细胞形成的可能影响

背景：种子细胞的成骨功能及局部血管形成是骨组织工程修复重要影响因素。目的：体外研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)诱导培养分化为成骨细胞的功能表现及血管内皮生长因子(vascular endothelia gmwth factor，VEGF)的表达。探讨MSCs向成骨分化及对血管内皮细胞形成的可能影响。设计：以细胞为研究对象，单一样本研究，重复观察测量。单位：一所大学组织胚胎学教研室。材料：本实验于2002-03／12在广东医学院组织胚胎学教研室完成。对象为兔骨髓间充质干细胞。方法：分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞，用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液诱导MSCs向成骨细胞分化，观察诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节形成以及VEGF的表达。主要观察指标：①细胞形态学观察。②培养细胞的成骨分化鉴定。③诱导培养的成骨细胞VEGF表达。结果：MSCs诱导培养后，细胞ALP呈强阳性染色，形成矿化结节，且VEGF表达增强，其灰度值为132．3&;#177;4．6，与MSCs的VEGF表达灰度值(148．5&;#177;5．3)比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：兔MSCs经诱导可分化为成骨细胞，且VEGF表达增强，可能参与内皮细胞的形成。     

表皮生长因子对外周血间充质干细胞原代克隆形成的影响及其传代后多向分化潜能

背景：目前已有很多实验证明外周血中存在间充质干细胞,但由于所用分离筛选方法、培养条件的不同导致了结果的多样性,且实验可重复性较差。目的：观察表皮生长因子对体外分离培养的原代小鼠外周血间充质干细胞克隆形成的影响,以及外周血间充质干细胞传代后的多向分化潜能。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-09在南京医科大学骨与干细胞研究中心完成。材料：雄性成年C57BL/6J小鼠16只,购于南京医科大学骨与干细胞研究中心实验动物中心。重组人表皮生长因子为Sigma公司产品。方法：无菌条件下从小鼠心脏采血,裂解红细胞后应用贴壁法分离外周血间充质干细胞,通过传代进行纯化和扩增。将原代细胞分2组进行体外培养,实验组向α-MEM培养液中加入10μg/L表皮生长因子,对照组给予不含表皮生长因子的α-MEM培养液,16d后行亚甲基蓝染色,计算克隆面积。取第3代外周血间充质干细胞,以1×10^4/cm^2密度接种后,分别向成骨和脂肪方向诱导分化。主要观察指标：外周血间充质干细胞的生长特性,外周血间充质干细胞体外诱导成骨、成脂能力。结果：倒置相差显微镜下,外周血间充质干细胞贴壁生长,形态类似于骨髓间充质干细胞,呈成纤维细胞样;但其形成克隆的时间较骨髓间充质干细胞有所推迟,且原代细胞克隆形成率低于骨髓间充质干细胞;亚甲基蓝染色结果示实验组外周血间充质干细胞克隆形成率明显高于对照组（P〈0.05）。外周血间充质干细胞成骨诱导后,碱性磷酸酶染色、总胶原染色及茜素红染色均呈强阳性;成脂诱导后油红染色呈阳性,有一定数量的脂滴形成。结论：外周血中存在少量的间充质干细胞,能自我增殖,表皮生长因子可有效促进原代外周血间充质干细胞克隆的形成;体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨和成脂分化特性。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

超顺磁性氧化铁纳米颗粒体外标记兔骨髓间充质干细胞的安全性以及MRI成像特征

背景：传统的干细胞标记方法常需要病理组织学等侵袭性手段检测,无法动态观察整个实验过程,也不适合临床研究。目的：观察超顺磁性氧化铁纳米颗粒体外标记对兔骨髓间充质干细胞生物学特性的影响以及标记兔骨髓间充质干细胞的体外MRI成像特征。方法：采用红细胞裂解贴壁法培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用不同浓度超顺磁性氧化铁纳米颗粒（100,50,25,12.5mg/L）联合多聚赖氨酸（0.75mg/L）标记兔骨髓间充质干细胞。对标记兔骨髓间充质干细胞进行MRI检测,观察其成像特征。结果与结论：25mg/L的超顺磁性氧化铁纳米颗粒联合0.75mg/L多聚赖氨酸标记兔骨髓间充质干细胞具有较好的安全性和有效性。此浓度对细胞的生长活性没有影响,不影响骨髓间充质干细胞的成骨成脂分化能力。MRI扫描在T2^＊WI序列上能明显有效地显像超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的兔骨髓间充质干细胞。     

壳聚糖凝胶活性载体与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶（Chitosan—disodiumB—glycerolphosphate，C／GP）与软骨细胞显示了良好的相容性，因此假设作为组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞也与C／GP凝胶有较好的细胞相容性。目的：观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶中生长、增殖和成软骨分化，探讨C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞的细胞相容性，为软骨组织工程材料寻找新的适宜细胞载体。设计、时间及地点：完全随机对照，细胞组织工程实验，于2005—10／2006—05在解放军第三军医大学西南医院中心实验室完成。材料：成年雌性小型猪6只用于收集骨髓，培养骨髓间充质干细胞。方法：取培养后传至第3代的骨髓间充质干细胞用于实验。在成骨培养条件下检测骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙沉积，在成软骨培养条件F行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。壳聚糖盐酸溶液与β-甘油磷酸钠溶液混匀后，置37℃孵箱内5～10min即形成壳聚糖β甘油磷酸钠凝胶。成软骨培养3周，倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内黏附及成活情况，组织免疫组织化学法分析骨髓间充质干细胞在凝胶内成软骨分化情况，MTT法检测骨髓间充质干细胞种植2，5和8d后增殖情况。主要观察指标：①猪骨髓间充质干细胞的特征。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活。⑧骨髓间充质干细胞在C／GP内的成软骨分化。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖。结果：①猪骨髓间充质干细胞的特征：体外培养的骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样形态，在成骨和成软骨诱导条件下可分别向成骨样细胞和软骨细胞分化。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活：MTT染色发现，骨髓间充质干细胞植入C／GP凝胶21d内，细胞黏附于凝胶内并保持90％以上成活。③骨髓间充质十细胞在C／GP内的成软骨分化：体外培养21d后成软骨诱导的骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内产生大量软骨基质。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖：成软骨诱导骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内持续增殖，细胞种植后2，5和8d，细胞增殖程度差异明显（P〈0．05）。结论：C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞显示了良好的细胞相容性，有利于骨髓间充质干细胞在其内生长、增殖和成软骨分化，有孳作为软骨组织工种的细胞载体。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的：观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。 方法：实验于2005—03／11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作：骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液（DMEM—LG培养基、体积分数为0．1的胎牛血清）常规培养；骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂；内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞；诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1：1的比例接种于培养板中，加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。 结果：①免疫细胞荧光染色结果：内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精一伊红染色结果：均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果：各组细胞增殖差异无显著性（P〉0．05）。④碱性磷酸酶活性：除内皮细胞诱导组外，其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高，联合培养组增长最明显，第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到（618．46&;#177;28．34）nkat／L，高于其他各组（P〈0．05）。⑤骨钙素检测结果：在培养的第7天、第14天，联合培养组的骨钙素分泌量分别为2．03，3．17μg／L，明显高于其他各组（P〈0．01）。 结论：由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性，提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨特征

背景：骨碎补能在促进骨生长且取得了良好的临床疗效,其主要成分柚皮甙能否诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化？目的：用柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。并观察柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。方法：用贴壁筛选法对兔骨髓间充质干细胞进行分离培养。对生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分别用50μg／L的柚皮甙和经典成骨诱导剂向成骨方向进行诱导,分别进行成骨鉴定。结果与结论：经典成骨诱导液、柚皮甙诱导液都能使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,基质分泌增多,形成钙结节。用酶联免疫检测仪检测柚皮甙诱导组和经典成骨诱导组细胞吸光度值未见明显的差异。同时检测柚皮甙诱导液和L—DMEN细胞培养液的吸光度值发现两者差异无显著性意义（P〉0．05）。证实柚皮甙可成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,无明显毒性作用。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的：观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法：实验于2004-10／2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只，经兔髂嵴无菌抽取骨髓，采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化，将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞，分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组（向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养，对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察），对照组（采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基），两组进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定，并进行细胞成脂和成骨率比较。结果：从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞，其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染，8只获得成功进入结果分析。①在经过2ld成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴，苏丹脂肪染色呈橘红色，同时Kossa法也检测出少许成骨分化，其比例为70％（28／40）干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞；10％（4／40）干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积，Von Kossa法测定形成的钙结节，同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化，其比例为40％（16／40）干细胞可转化为成骨细胞，20％（8／40）骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5％（2／40）骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，用Von Kossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10％（4／40）。结论：在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞，另一部分转化为成骨细胞，两者分化存在一定关系：分化的脂肪细胞多，则成骨细胞少；分化的成骨细胞多，则脂肪细胞少。