氧化铁磁性纳米颗粒介导wt p53基因对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的: 探讨氧化铁磁性纳米颗粒介导野生型p53基因（wild type p53,wtp53）对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP增殖抑制和凋亡诱导的作用。 方法:氧化铁磁性纳米颗粒介导wtp53转染肺腺癌细胞A549/DDP作为实验组，以纳米颗粒介导空载体pcDNA3转染作为阴性对照     

氧化铁纳米颗粒作为p53基因载体并转染肺癌细胞的可行性研究

目的:体外评价表面修饰多聚赖氨酸的氧化铁磁性纳米颗粒作为野生型p53基因载体并转染肺癌细胞的可行性。方法:以碱沉淀法制成外包葡聚糖的氧化铁磁性生物纳米颗粒(dextran coated iron oxide nanoparticles,DCIONP),在其表面修饰多聚赖氨酸制成多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒(dextran coated iron oxide nanoparticles modified with polyL-lysine,pll-DCIONP)。扫描电镜观察其形态特征,用激光粒度检测仪测定其粒度分布和Zeta表面电位;分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析pll-DCIONP与野生型p53基因的结合力及其复合物抵抗DNase-Ⅰ和血清消化的能力;pll-DCIONP作为野生型p53基因载体转染人肺腺癌细胞A549/CDDP,RT-PCR以及Western印迹法分析细胞内p53基因的表达。结果:pll-DCIONP的直径在60~80nm之间,Zeta电位为 19.6 mV;pll-DCIONP无论在酸性、中性及碱性的条件下,均可与野生型p53基因结合,二者质量比为1∶1时结合力最强;pll-DCIONP/wt-p53复合物能抵抗DNase-Ⅰ和血清对野生型p53基因的消化作用;以pll-DCIONP作为野生型p53基因载体转染人肺腺癌细胞,随着时间延长,细胞内p53基因含量持续增高,而以脂质体作为转染载体时随着时间延长细胞内p53基因含量递减。结论:pll-DCIONP可作为野生型p53基因理想的转染载体,并能持续高效地将外源性p53基因转染入肺癌细胞中。     

凋亡抑制基因c-FLIPs对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨过表达凋亡抑制基因c-FLIPs重组腺病毒对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用。方法:构建过表达凋亡抑制c-FLIPs的重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,感染人肺腺癌细胞Calu-3。Real-time PCR检测感染前后c-FLIPs、Caspase-8,Caspase-10和Bcl-2的表达。MTT法检测细胞增殖。流式细胞仪检测感染Ad5 c-FLIPs后人肺腺癌细胞的凋亡情况。结果:成功构建过表达c-FLIPs重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,real-time PCR检测凋亡抑制基因c-FLIPs在Calu-3细胞株高表达,过表达c-FLIPs基因,凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-10和Bcl-2的表达明显降低。MTT法检测感染前后细胞增殖情况发现,过表达c-FLIPs基因可诱导细胞增殖,流式细胞仪分析经PI染色后的Calu-3细胞株,对照组和腺病毒感染组细胞的凋亡率分别为（55.17±9.68）%和（10.97±1.66）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:凋亡抑制基因c-FLIPs可明显诱导人肺腺癌细胞增殖并抑制凋亡。     

用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的研究

目的：评价氧化铁磁性纳米颗粒（nanoparticles)作为基因载体的可行性。方法：应用沉淀法制成外包葡聚糖的氧化铁磁性生物纳米颗粒9Dextran Coated Iron Oxide Nanoparticles,DCIONP)。用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性生物纳米颗粒的DNA结合力及抵抗DNASE-Ⅰ消化的作用,以绿色荧光蛋白基因为报道基因,进行用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的体外细胞转染实验。结果：电镜检测证实DCIONP的直径在10纳米（nanometer,nm)左右。在酸性条件下,这种纳米颗粒表现出DNA结合力和抵抗DNASE-Ⅰ消化的作用,从而证明DCIONP与DNA的结合是静电引力的作用。在氧化铁磁性生物纳米颗粒表面修饰阳离子聚合物多聚赖氨酸（Dextran Coated Iron Oxide Nanoparticles modified with Poly-L-Lysine,PLL-DCIONP)在中性及碱性的条件下,亦可与带阴性电荷的DNA结合及抵抗DNASE-Ⅰ消化的作用,PLL-DCIONP可作为基因载体将报道基因转染入细胞,用荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞。在PLL-DCIONP和质粒的质量成一定的比例时,PLL-DCIONP的转染效率高于脂质体。结论：PLL-DCIONP可作为DNA转移载体。     

腺病毒介导野生型p53基因诱导膀胱癌细胞凋亡

p53基因是一种抑癌基因,它在肿瘤发生过程中有重要作用.p53基因的突变可引起细胞增殖,导致悼瘤的发生.迄今已在许多恶性肿瘤细胞中发现p53基因的突变.将外源野生型p53基因导入p53基因突变的肿瘤细胞,能抑制其恶性增殖,逆转其恶性表型.这些研究为肿瘤的基因治疗奠定了基础;值得注意的是,至今大多数研究均用有p53基因缺失或突变的肿瘤细胞,但并非所有的肿瘤细胞都发生p53基因突变;本文将外源野生型p53基因导入表达内源野生型p53基因的膀胱癌细胞株EJ,观察其抑制效应及凋亡的诱导作用.     

转染野生型p53对乳腺癌细胞所致细胞凋亡的研究

为研究ｐ５３对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,用重组人野生型ｐ５３全长ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染Ｂｃａｐ３７细胞,观察其增殖的凋亡变化。方法 应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测Ｂｃａｐ３７细胞表达变化,流式细胞仪计数检测细胞增殖及周期变化,ＭＴＴ及苔盼兰计数观察紫外线刺激后细胞存活率差异,ＤＮＡ末端原位标记技术检测细胞凋亡变化。     

外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响

了解外源野生型ｐ５３（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３,ｗｔｐ５３）基因表达对人大细胞肺癌８０１－Ｄ细胞对化疗药物敏感性的影响。方法选用Ｐ５３基因突为的人大细胞肺癌８０１－Ｄ系。用脂质体介导构建的含ｗｔｐ５３基因载体转染８０１－Ｄ细胞,ＰＣＲ检测外源ｗｔｐ５３在宿主细胞存在情况,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定８０１－Ｄ细胞转染ｗｔｐ５３后药物敏感性变化,流式细胞仪（ＦＡＣＳ）分析细胞死亡情况。结果转染ｗｔｐ５     

转染 p53基因对肺腺癌细胞株裸鼠 移植瘤生长的影响

目的：探讨转染野生型 p53（ wt-p53）和突变型 p53（ mt-p53）基因对人肺腺癌细胞株 GLC-82裸鼠移植瘤生长的影响。方法：采用脂质体介导法,分别将 wt-p53和 mt-p53基因导入人肺腺癌细胞株 GLC-82,在裸鼠体内、体外实验中检测转导细胞的生长状况和裸鼠致瘤性。结果：转染 mt-p53 基因的细胞株 G418筛选的细胞集落数、 3H-TDR掺入实验、软琼脂平皿细胞集落数,以及裸鼠瘤组织重量和体积均高于对照组（ P<0.01）,而转染 wt p53基因的细胞株均显著低于对照组（ P< 0.01）,表明导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度明显低于对照组细胞株和导入 mt p53基因的细胞株,即导入 mt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最快,而导入 wt p53基因的细胞株瘤细胞生长速度最慢。结论： wt p53基因能有效抑制人肺腺癌细胞生长; mt p53基因则可以明显地促进瘤细胞生长。     

丁酸钠诱导HT 29结肠癌细胞凋亡及其对 p 53靶基因的调控

目的：〖HT5"SS〗分析丁酸钠对HT29结肠癌细胞p53三个主要靶基因（p21waf1,bax和gadd45）的调控,并探讨其作用机制。〖HT5W〗方法：〖HT5"SS〗HT29细胞常规培养在含有和不含有丁酸钠的培养液中。分别用MTT和流式细胞仪(flow cytometry,FCM) 检测细胞增殖和细胞周期分布,通过形态学观察、亚G1峰的检测和AnnexinVFITC 双标记观察细胞凋亡情况;RTPCR和Western blot分别检测丁酸钠对p21waf1,bax和gadd45三种基因mRNA和蛋白表达水平的影响。〖HT5W〗结果：〖HT5”SS〗丁酸钠以剂量和时间依赖的方式抑制HT29细胞增殖和诱导凋亡,并阻滞细胞于G1期。RTPCR 和Western blot结果显示丁酸钠可以促进p21waf1和bax基因mRNA和蛋白的表达,而对gadd45基因的表达无明显影响。〖HT5W〗结论：〖HT5”SS〗2.5 mmol/L以上浓度的丁酸钠可以抑制HT29细胞增殖并诱导凋亡,该作用可能通过上调p21waf1和bax基因表达而实现。     

p73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响

背景与目的:实验证明野生型p53基因能增强大多数非小细胞肺癌的化疗敏感性。p53基因的同源体p73与其在结构和功能上都具有高度的相似性。本研究拟探讨p73基因对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响。方法:通过脂质体介导将p73α基因导入人肺腺癌细胞株H1299,G418筛选获得稳定表达P73α的阳性细胞克隆。Westernblot检测转染细胞中P73α蛋白的表达;MTT法检测细胞存活率,观察转染细胞对阿霉素、顺铂的敏感性变化;采用流式细胞仪和TUNEL法检测.p73646化疗药诱导前后转染细胞凋亡的变化;克隆形成实验观察细胞生物学性状的变化。结果:转染p73α基因的H1299细胞可以稳定高表达P73α蛋白。MTT实验提示顺铂和阿霉素的IC50值分别减少了86.2%和99.2%,转染细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度(1.25μmol/L的顺铂或0.05μmol/L的阿霉素)作用下生长明显受到抑制。流式细胞术显示p73α基因转染后顺铂诱导的细胞凋亡率从10.1%升高到38.4%(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从12.1%升高到49.3%(P<0.01)。克隆形成实验显示p73α基因转染能明显降低化疗后H1299细胞的克隆形成数(P<0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为1.8和2.6倍。结论:转染p73基因可以提高H1299细胞对阿霉素、顺铂等化疗药的敏感性。该作用可     

ADENOVIRUS-MEDIATED WILD-TYPE P53 EXPRESSION SUPPRESSES GROWTH OF LUNG ADENOCARCINOMA CELLS

ＷｉｌｄｔｙｐｅＰ５３ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｓ，ａｎｄｉｓｔｈｅｒｅｆｏｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｏｒｇｅｎｅ．１ＭｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＰ５３ｇｅｎｅａｒｅｒｅｐｏｒｔｅ...     

Retinoblastoma protein-initiated cellular growth arrest overcomes the ability of cotransfected wild-type p53 to induce apoptosis

The retinoblastoma gene, RB, participates in the regulation of the G1/S-phase transition and in p53-mediated apoptosis. We have previously reported that stably transfected RB functions as a growth and tumour suppressor in HTB9 human bladder carcinoma cells, which carry a mutation of the p53 gene at codon 280 and lack RB expression. To elucidate the potential role of RB in the regulation of p53-mediated apoptosis, we transfected a wt p53 expression plasmid under the control of the human cytomegalovirus promoter into parental and RB-transfected HTB9 cells. The p53(+)/RB(-)cells were susceptible to apoptosis under various experimental conditions: 1) incubation in serum-free culture for 72 h, 2) short-term (6 h) or long-term (48 h) exposure to etoposide, and 3) culturing in soft agar. In contrast, p53(+)/RB(+)cells were significantly resistant to apoptosis under similar conditions and exhibited efficient growth arrest, as measured by laser scanning cytometry. Tumorigenicity in nude mice of parental HTB9 cells was lost by exogenous expression of wt p53. Likewise, none of mice injected subcutaneously with either p53(-)/RB(+)or p53(+)/RB(+)cells developed tumours, indicating that RB allows suppression of tumorigenesis, regardless of p53 status. These results suggest that the growth-inhibitory function of RB may overcome the ability of wt p53 to induce apoptosis.     

Induction of differentiation by wild-type p53 gene in a human glioma cell line

Wild-type human p53 gene was transfected into the human glioma cell line T-98G. Transfectants were then isolated and characterizedfor growth potential and differentiation phenotype. Growth suppression,overexpression of GFAP, and accumulation in G₁phase were more commonly observed in transfectants than inT-98G cells. p21_WAF1/CIP1 wasoverexpressed in transfectants, and the binding of PCNA and CDK 2 top21_WAF1/CIP1 were increased in transfectants. These results suggested the roles of p21_WAF1/CIP1, PCNA,and CDK 2 in regulation of differentiation in glioma cells and the gene transfer of wild-type p53 may be effective forthe control of glial differentiation in glioma cells.     

紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞作用的研究

目的:观察紫杉醇对3种不同p53基因型肺癌细胞的作用。方法:以不同浓度紫杉醇(0.1、1.0、10、100、1 000nmol/L)分别作用肺癌细胞A549、H322、H1299不同时间(4、12、24、48、96 h),实验同时设阴性对照组(不加紫杉醇)和空白对照组(只加细胞培养液)。采用MTT、流式细胞术、Western blotting检测细胞的生长及细胞周期、凋亡、乙酰化微管蛋白、p53蛋白等指标变化。结果:紫杉醇对3株肺癌细胞的生长抑制作用均随着作用时间的延长而增强(P0.05);不同浓度紫杉醇对3株细胞生长的影响也存在差异(P0.05)。3株细胞中A549细胞半数抑制浓度相对较低,但3株细胞间对紫杉醇敏感性的差异无统计学意义(P0.05)。紫杉醇10 nmol/L作用时,3株细胞G2/M期变化趋势基本一致,1 000 nmol/L作用时,A549细胞G2/M期比例与作用时间呈正相关(P0.05),H322和H1299的G2/M细胞于24 h达高峰,作用后期H1299出现异常多倍体;同浓度紫杉醇作用的各株肺癌细胞的凋亡呈时间依赖性,但1 000 nmol/L组诱导的细胞凋亡比10 nmol/L组更晚出现。浓度依赖性实验中,10 nmol/L诱导凋亡比例最高;紫杉醇浓度≤100 nmol/L时,G2/M期比例随浓度增加而增高(P0.05);紫杉醇浓度≥100 nmol/L时,各肺癌细胞株G2/M期比例间的差异无统计学意义。凋亡和G2/M期阻滞无相关性(P0.05)。紫杉醇作用后,A549细胞p53蛋白呈浓度和时间依赖性增加,H322细胞p53蛋白无明显变化。3株细胞乙酰化微管蛋白均较对照组显著上升(P0.05)。结论:紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞生长的抑制作用呈时间依赖性。紫杉醇可增加野生型p53蛋白表达,诱导p53依赖和非p53依赖的两种凋亡途径,p53基因型影响了高浓度紫杉醇对肺癌细胞的周期阻滞作用,但对紫杉醇化疗敏感性无显著影响。     

Therapeutic potential of recombinant p53 overexpression in breast cancer cells expressing endogenous wild-type p53

Reconstitution of the p53-dependent apoptotic pathway by gene transfer of a recombinant wild-type p53 minigene leads to rapid apoptotic cell death in breast and other cancer cell types expressing null or mutant p53. Tumour cells expressing wild-type p53 have been reported to be more resistant to this treatment strategy, presumably as a result of mutations in downstream regulators of p53-dependent apoptotic signalling. The MCF-7 breast cancer cell line is representative of this class of tumour cell. Our recent observation of a p53-dependent apoptotic response following adenovirus-mediated HSV thymidine kinase gene transfer and gancyclovir treatment led us to reexamine recombinant p53 cytotoxicity in MCF-7 cells. Infection with a recombinant adenovirus expressing wild-type p53 resulted in a dramatic increase in p53 protein levels and was accompanied by an increase in p21^{WAF 1/CIP1} protein levels and G1 arrest within 24 hours post-infection. A significant decrease in MCF-7 cell viability was first observed at 5 days post-infection and coincided with the appearance of morphological and biochemical changes consistent with apoptotic cell death. By day 7 post-treatment, cell viability decreased to 45% and clonogenic survival was reduced to 12% of controls. The results demonstrate that persistent, high level expression of recombinant p53 can induce programmed cell death in MCF-7 cells. While the mechanism by which p53 overexpression overcomes the defect in downstream apoptotic signalling is not clear, our data suggests that this treatment strategy may be beneficial for the class of tumour cells represented by the MCF-7 cell line.     

转染p16基因对人肺腺癌细胞放射效应的影响

目的 :探讨p16基因与人肺腺癌细胞放射效应的关系。方法 :免疫组化、Westernblot方法检测人肺腺癌细胞株Anip973、AGZY83a的p16蛋白表达 ,FuGene转染方法把 p16表达载体转入这两个细胞株 ,进行细胞存活曲线、流式细胞仪 (FCM )分析细胞周期分布。结果 :p16蛋白表达AGZY83a为 87.4 % ,明显高于Anip973(5 2 % ) ,细胞存活曲线显示低表达的Anip973与转染后Anip973p16的Dq值有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,D0 值间无显著差异 (P >0 .0 5 )。p16蛋白高表达的AGZY83a与AGZY83ap16间D0 值、Dq值均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;流式细胞仪测定细胞周期结果显示 ,Anip973转染 p16基因后出现G2 M期比例增加 ,S期比例减少。结论 :转染 p16基因后可能通过改变细胞周期分布及抑制细胞对照射后的亚致死性损伤修复 ,来改变p16蛋白低表达的人肺腺癌细胞株Anip973的放射效应 ,而对于高表达的AGZY83a则无显著影响。