端粒酶hTERT基因反义核酸对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响

目的 探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响.方法 采用TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化.结果 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)作用于T24细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制.结论 通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性.     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

RNA干扰技术对HeLa细胞hTERT基因的抑制作用

目的 探讨RNA干扰对宫颈癌HeLa细胞人端粒酶反转录酶基因的抑制效应。方法 化学合成靶向于hTERT基因的siRNA,用阳离子脂质体转染法将其导入宫颈癌细胞内。实验分组:转染组siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、阴性对照组(siRNA-NC)、空白对照组(Blank)。通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 siRNA-3组的端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平显著下降,hTERT蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显升高,与其他各组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 运用RNAi干扰技术,以hTERT基因为靶点的siRNA能特异性抑制宫颈癌HeLa细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制宫颈癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据。     

外源性端粒酶催化亚单位对人视网膜血管内皮细胞的影响

目的探讨外源性人端粒酶催化亚单位(hTERT)对人视网膜血管内皮细胞(hRCEC)端粒酶活性、相关基因表达和体外生存时间的影响。方法阳离子脂质体介导hRCEC转染;RT-PCR法检测人类端粒酶RNA组份(hTR)、端粒酶相关蛋白1(TEP1)及hTERT基因的表达;TRAP法检测端粒酶活性;细胞计数法绘制生长曲线。结果hTR、TEP1基因在hTERT转染hRCEC前后都表达,hTERT基因在转染前不表达,转染后24h及稳定转染克隆形成时表达,细胞停止分裂时又失去表达;转染前无端粒酶活性,转染后24h及稳定转染克隆形成时可检测到端粒酶活性,细胞停止分裂时端粒酶活性消失;稳定转染了hTERT基因后hRCEC的生存时间没有延长。结论hTERT转染可显著提高hRCEC中hTERT基因表达水平,hTERT基因表达与端粒酶活性一致,但只用hTERT转染的方法不能使hRCEC细胞生存时间延长。     

外源hTERT基因对大鼠肝细胞增殖的影响

目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响.方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况.结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖.结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础.     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响。方法构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(pshRNA-hTERT)并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点。结果转染乳腺癌细胞后,pshRNA-hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2%;蛋白表达分别下调46.6%,47.8%。端粒酶活性均明显下降。对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加。结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

Bcl-2和p53基因对永生化软骨细胞端粒酶活性影响的实验研究

目的：探讨原癌基因bcl-2 和肿瘤抑制基因p53调节永生化细胞端活性的机理。方法：兔髁突软骨细胞通过真核表达载体转梁人端粒酶催化亚基hTERT，经G418筛选，挑选阳性克隆培养，使用原位杂交和荧光TRAP检测转染细胞bcl-2和p53 Mrn水平和端粒酶活性。结果：未转染的细胞无端粒酶活性；100代转染后的软骨细胞端粒粒酶活性明显高于未转染细胞；同时 bcl-2 mRNA和p53 mRNA水平有所降低， bcl-2 mRNA水平明显低于未转染hTERT和端粒阴酶软骨细胞。结论 bcl-2和p53参与了细胞永生化过程中端粒酶活性的调节。     

重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞寿命及其成骨细胞潜能的影响

目的:观察重建端粒酶活性对成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的寿命及成骨潜能的影响.方法:将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因通过脂质体转染法导入成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,RT-PCR检测转染细胞hTERT mRNA的表达,TRAP-PCR检测细胞端粒酶活性.Von-Kossa染色及RT-PCR检测已重建端粒酶活性的脂肪源细胞向成骨细胞分化的潜能.结果:转染hTERT的成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能稳定表达端粒酶活性.转染后第75代的细胞仍维持着自我更新及向成骨细胞分化的潜能,且无恶性转化倾向.结论:重建端粒酶活性可延长成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞寿命,并维持其自我更新及成骨潜能.     

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的：建立永生化人成牙本质细胞系．方法：采用脂质体转染法，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞．培养液加G418筛选约1mo后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增并连续培养．检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达，初步分析细胞系的生物学特征．结果：hTERT稳定转染入目的细胞，表达mRNA及其蛋白．转染后共获得5个细胞克隆，克隆5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，具有较高碱性磷酸酶活性，在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白，细胞核型正常．该细胞系至今传代56代，约6mo，命名为hTERThOd-L结论：建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系．     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人成骨细胞永生化的研究

目的建立永生化的人成骨细胞系供骨科临床和基础研究使用。方法将人骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞,以逆转录病毒为载体,导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆,体外连续传代,检测hTERT基因的整合情况及其表达,并对不同代次细胞的成骨特性进行了检测。结果成功地将hTERT基因转入人成骨细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至62代,对第25、第55代转化细胞分别进行碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥素的检测,证明此永生化细胞保持了良好的成骨特性。结论转导外源性的hTERT基因可以导致人成骨细胞永生化且可保持其正常的成骨特性。     

hTERT上调FOXM1乙酰化影响胃癌细胞侵袭能力

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)促进胃癌细胞侵袭的分子机制.方法 构建稳定过表达hTERT的细胞株SGC-7901-hTERT,采用Western blot检测叉头盒蛋白(forkhead box M1,FOXM1)的表达,qRT-PCR和Western blot检测FOXM1下游侵袭相关基因基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1的shRNA干扰质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中转染该质粒,Transwell法检测细胞侵袭能力,qRT-PCR和Western blot检测MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达;构建FOXM1启动子活性报告质粒,在SGC-7901-hTERT细胞中用双荧光素酶报告实验检测FOXM1启动子活性,qRT-PCR检测FOXM1 mRNA表达;构建稳定过表达FOXM1的细胞株SGC-7901-HA-FOXM1,并在此细胞中转染hTERT过表达质粒,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测FOXM1乙酰化水平变化,免疫荧光实验检测hTERT与FOXM1的细胞定位.结果 与对照组比较,过表达hTERT促进FOXM1及其下游分子MMP-2、MMP-9的蛋白表达,同时也促进肿瘤细胞侵袭(P＜0.01),但不影响FOXM1的启动子活性及mRNA表达;与过表达hTERT组比较,干扰FOXM1可抑制MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达,同时也抑制肿瘤细胞侵袭(P＜0.01);hTERT与FOXM1存在细胞共定位,且过表达hTERT可上调FOXM1乙酰化水平.结论 hTERT通过上调FOXM1乙酰化促进胃癌细胞侵袭.     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

RNA干扰抑制肝癌QGY细胞株hTERT基因表达的研究

目的 利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi对肝癌细胞增殖的抑制效应.方法 设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-hTERT并导入人肝癌细胞系QGY细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA-hTERT的细胞株.采用real time RT-PCR、MTT和PCR-TRAP法同时检测pGenesil-shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理QGY细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果 在稳定表达pGenesil-shRNA-hTERT的QGY细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERT的mRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制.结论 RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT的mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是潜在的肿瘤基因治疗新方法.     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．