大鼠核因子-κB反义RNA腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建表达大鼠核因子κB(NF- κB ,p6 5 )反义RNA的重组腺病毒,并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs)中NF -κB基因的表达变化。方法:从自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)的VSMCs中提取总RNA ,经RT PCR方法获得含全部编码序列的NF κB (p6 5 )cDNA片段(16 5 3bp) ,用TA克隆技术插入pMD18 T载体,构建pMD18 T/16 5 3重组质粒,并经酶切和DNA测序鉴定。以该质粒为模板,经PCR获得NF κB(p6 5 ) 3’端2 6 9bp片段,逆向插入pcDNA3.1( )真核表达载体并置于CMV启动子下。由此构建的pcDNA3.1( ) /2 6 9质粒含有NF κB(p6 5 )的2 6 9bp反义RNA完整表达框。随后将该表达框克隆到入门载体pENTR4 ,构建重组质粒pENTR4 /CMV/2 6 9。使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL DEST ,最终得到重组腺病毒质粒pAd/CMV/2 6 9。线性化的重组腺病毒质粒转染2 93细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs的感染。WesternBlot测定感染前后VSMCs中NF- κB(p6 5 )表达的变化情况。结果:构建的pMD18 T/16 5 3重组质粒经过序列测定,证实其包含大鼠NF κB(p6 5 )基因的16 5 3bp片断;pcDNA3.1( ) /2 6 9、pENTR4 /CMV/2 6 9、pAd/CMV/2 6 9等重组质粒经内切酶消化或PCR等方法鉴定无误;线性化的pAd/CMV     

重组pAd/CMV/V5-DEST-p16载体的构建及其对人肝癌细胞的抑制作用

目的构建pAd/CMV/V5-DEST-p16重组腺病毒载体,并观察野生型p16基因对人肝癌细胞SMMC7721株的抑制作用。方法合成人p16-INK4表达基因。构建pENTR 1A-p16质粒。通过LR反应,入口克隆pENTR 1A-p16质粒的外源性合成的修饰后的p16 cDNA,取代目的载体pAd/CMV/V5-DEST中的ccdB基因,形成表达克隆pAd/CMV/V5-DEST-p16。测序证实质粒含有目的基因。PacI酶切后的重组腺病毒载体,通过脂质体2000介导,转染293A细胞,产生缺陷性的重组腺病毒。W estern blot分析显示在由重组腺病毒介导的野生型p16基因在肝癌细胞SMMC7721中能够表达蛋白。被感染的细胞的生长受抑制。结果构建了重组p16腺病毒载体,产生缺陷性的重组腺病毒,野生型p16基因对人肝癌细胞SMMC7721株有抑制作用。结论用通路克隆系统构建重组p16腺病毒载体稳定、可靠、方便,腺病毒能够介导野生型p16基因在肝癌细胞中表达,并抑制细胞的生长。     

人类U5·116 ku蛋白基因片段的克隆

目的:构建人类U5·116 ku基因全长真核表达质粒。方法:从HeLa细胞中提取总体RNA,一步法合成单链cDNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,扩增出人类U5·116 ku基因两段连续的序列,首先分别克隆至pTZ57R/T载体,两段序列连接成全长后再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒。结果:RT-PCR法获得U5·116 ku基因两段连续的序列,长度分别为1672bp和1246bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1(-)真核表达载体进行连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒构建成功。结论:成功克隆了人类U5·116 ku的编码基因,并构建了其真核表达质粒pcDNA3.1(-)-U5·116 ku。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

双氢青蒿素对BXSB小鼠狼疮肾炎的作用及机制研究

目的　观察双氢青蒿素 (Dihydroqinghaosu ,DQHS)对BXSB小鼠狼疮肾炎 (LN)病理改变的影响及对其肾组织核蛋白提取物中核转录因子 κB(NF κB)活化和NF κBp6 5蛋白表达的影响 ,探讨DQHS治疗系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus,SLE)的分子机制。 方法　对低温冰冻肾组织进行免疫荧光检测 ;用Westernblot的方法检测肾组织核蛋白提取物中NF κBp6 5蛋白的表达 ;以凝胶电泳迁移率改变试验 (Electrophreticmobilityshiftassay ,EMSA)对NF κB的活化进行检测。结果　免疫荧光检测显示 :模型对照组及DQHS(5mg·kg-1)剂量组小鼠肾脏组织中多种免疫球蛋白 (IgG ,IgA ,IgM)和补体 (C3 ,C1q)的荧光检测呈强阳性 ,DQHS高剂量 (12 5mg·kg-1)和中剂量 (2 5mg·kg-1)组除IgG和补体C3 呈微弱阳性外 ,IgA ,IgM和补体C1q均为阴性 ;与正常组相比较 ,BXSB小鼠肾组织核蛋白提取物中NF κB的活化及其p6 5蛋白的表达均增加 ,其中 p6 5蛋白表达的增加差异具有显著性 (P <0 0 1) ;与模型组相比较 ,DQHS3个剂量 (12 5、2 5、5mg·kg-1)组BXSB小鼠肾组织核蛋白提取物中NF κB的活化及其p6 5蛋白的表达均有不同程度的降低 ,其中 p6 5蛋白表达的降低差异具有显著性 (P <0 0 1)。结论　DQHS能抑制肾组织中NF κB的活化及其     

胞质蛋白NOD2重组腺病毒载体的构建

目的构建人NOD2腺病毒表达载体。方法采用分子克隆技术,从CoCa2细胞DNA中PCR扩增NOD2片段,经pcDNA3．1克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV,以KpnⅠ和NotⅠ双酶切重组穿梭质粒,经电穿孔、抗性筛选,重组成pAdCMV-NOD2腺病毒质粒,经酶切鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组rvAdCMV-NOD2腺病毒,并进行PCR鉴定测定。结果成功扩增目的基因并鉴定,重组穿梭质粒pShuttle-CMV-NOD2鉴定,经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功。结论腺病毒载体应用广泛,细菌体内同源重组腺病毒pAdCMV-NOD2合成效率高,为炎症的基因治疗研究奠定基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

人Prp8蛋白基因片段的克隆

目的：构建人Prp8基因全长真核表达质粒。方法：从HeLa细胞中提取总体RNA,两步法合成cDNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,扩增出人Prp8基因的四段序列,首先克隆至pTZ57R/T载体,再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒。结果：RT-PCR法获得Prp8基因的4段序列,长度分别为2025、1090、1966、1963bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1（＋）真核表达载体连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒构建成功。结论：成功克隆了人Prp8的编码基因,并构建了表达载体pcDNA3.1（＋）-Prp8。     

p 16 基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究

目的探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用。方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;经Western blot证实,转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

CDC25b突变载体的构建及其在小鼠受精卵中的表达

目的构建小鼠细胞分裂周期蛋白25b(CDC25b)突变基因的真核表达载体,并观察其在小鼠G₂期受精卵细胞中的表达。方法采用PCR法从野生型CDC25b模版上扩增CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)突变基因,定向插入pcDNA3.1(+)-3flag-C空载体中,由限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切电泳后测序验证,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)。采用脂质体法将其转染至Stbl3感受态细胞,质粒经在感受态细胞内转化、抽提、酶切及测序鉴定正确后,将重组真核表达质粒用显微注射法注射至小鼠G₂期受精卵内,采用Western blot法检测重组质粒突变型CDC25b的表达。结果 pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)真核表达载体经酶切和测序鉴定,酶切结果显示与目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确;将其注射至小鼠G₂期...     

利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4

目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

NF-κB、细胞凋亡与肿瘤治疗

NF κB是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子 ,是由 p5 0和 p6 5 (Rel A)两个亚单位构成的异源二聚体 ,p5 0是核因子与DNA结合的部分 ,p6 5是与抑制蛋白IκB结合的部分。NF κB与抑制蛋白IκB结合以非活性的状态存在于大多数细胞的胞浆中 ,后者阻止NF κB进入胞核与DNA结合。许多刺激 (如细胞因子、蛋白激酶C激活剂、氧化剂、病毒、免疫刺激剂、脂多糖和紫外线等 )可激活NF κB ,使IκB迅速磷酸化和降解 ,被激活的NF κB会进行核转移 ,与DNA启动子上特定的认知序列结合 ,转录靶基因。NF κB调节许多重要的功能 ,如参与…     

大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及在肾系膜细胞中的表达

目的 利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体,转染大鼠肾小球系膜细胞(GMC),并通过Western Blot法检测GR蛋白的表达.方法 将质粒pcDNA1 Neo-Rat GR扩增、凝胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR,经人胚肾293A细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR;用包装后的病毒上清转染大鼠GMC,提取细胞中总蛋白,通过Western Blot方法 检测GR蛋白的表达.结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒,经人胚肾293细胞包装,48 h后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得1×109 PFU /ml 滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-Rat GR,转染大鼠GMC 48 h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测GR蛋白有明显表达.结论 构建的大鼠GR基因腺病毒载体能够在大鼠GMC 中表达GR蛋白,并有上调作用.     

用表达TTFC的重组戈登链球菌免疫的小鼠能抵抗TT的致死性攻击

分子量为 5 0 k Da的破伤风毒素 (TT)羧基末端—— TTC片段 (TTFC)能结合神经节苷脂 ,它没有毒性但却具有免疫原性 ,能够诱生使小鼠免于致死性攻击的中和抗体。因为在小鼠模型中能很好地建立 TT攻击 ,所以 TTFC的表达常用来评价疫苗载体诱生保护性抗体的能力。　　作者将 TTFC编码基因插入质粒p SMB5 5构建新的重组质粒 p SMB15 8,然后再用重组质粒转化戈登链球菌 GP12 2 1株成重组株 GP12 5 3。用 10 9CFU的重组株GP12 5 3和对照株 GP12 5 2 (表达牛白蛋白 )10 0μl间隔 3周分别皮下注射 6周龄雌性BAL B/ c和 C5 7BL / 6…     

急性脊髓损伤时核因子κB与胶质原纤维酸性蛋白相关性研究

目的　明确急性创伤性脊髓损伤 (acutespinalcordinjury,ASCI)后胶质原酸性蛋白 (glialfibril laryacidicprotein ,GFAP)变化分布 ,以及与核因子κB(NF κB)变化的关系。方法　将 2 8只SD大鼠随机分为对照组与损伤组 ,制作脊髓损伤模型 ,使用免疫组化分别测试GFAP与NF κB在急性脊髓损伤后的变化。结果　ASCI后 6h ,白质内GFAP表达开始增强 ,ASCI后 5d ,灰白质内仍有大量的GFAP阳性表现 ;AS CI后 1h ,NF κB的免疫反应在病灶内和边缘部位可以探测到 ;ASCI后 5d ,NF κB的反应明显减少。结论　NF κB部分参与了脊髓损伤后GFAP表达 ,抑制NF κB的表达 ,将一定程度上抑制GFAP表达。     

重组hPPAR-α受体表达质粒的构建

目的构建人PPAR-α受体的重组表达质粒。方法从基因库获取人PPAR-α基因蛋白编码区全长序列,依照引物设计原则及编码序列上已有酶切位点设计引物并添加酶切位点。从正常肝组织细胞提取总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增目的片段,克隆到pcDNA3.1真核表达载体,测序鉴定重组质粒目的基因蛋白编码区全长序列及开放阅读框的正确性,命名为pcDNA-hPPAR-α。结果核酸测序结果表明所得pcDNA-hPPAR-α的蛋白编码全长序列与基因库一致,正向插入载体pcDNA3.1多克隆位点NheⅠ和KpnⅠ之间,开放阅读框正确。结论成功构建重组质粒pcDNA-hPPAR-α。     

尿激酶受体反义RNA真核表达质粒的构建

目的构建尿激酶受体(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究通过UPAR干预类风湿关节炎的发生发展提供实验基础。方法取冰冻保存的小鼠肝癌组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因(UPAR)cDNA片段。用CaCl2法诱导感受态细胞。将真核载体pcDNA3.1(-)在多克隆位点处用HindⅢ、BamHⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和UPAR基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义UPAR基因表达质粒;转化JM109大肠杆菌;酶切证实的阳性克隆行测序分析。结果琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好;RNA浓度为450mg/L;阳性克隆经双酶切后行10g/L琼脂糖电泳,在DNAMarker500bp和5.3bp附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功;DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论反义UPAR真核表达重组质粒构建成功。     

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制.方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)-EGFP中、构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+ )/LL37-EGFP.(2)经组织块法原代培养入阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况.结果:成功构建了pcDNA3.1( +)/HD5-EGFP和pc DN A3.1(+ )/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24h时表达量最高.联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.001).LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6h时分泌最低,24h达高峰,然后呈下降趋势.HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势.结论:HD5和LL37成功转染人人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础.