阿魏酸钠对血管平滑肌细胞热休克蛋白27磷酸化的影响

目的： 研究阿魏酸钠对血管紧张素II（angiotensinⅡ,AngII）与血小板源性生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）磷酸化的影响。方法：采用体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞；用特异性的单克隆phospho-HSP27抗体的蛋白印迹法（Western blotting）检测HSP27的活性。结果：阿魏酸钠以剂量依赖性方式抑制AngII和PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化，在10-4 mol/L〖JP2〗时抑制作用最明显，最大抑制率分别为39.0%（P<0.05）和56.8%（P<0.01）。结论：阿魏酸钠具有明显抑制由AngII和PDGF-BB诱导的VSMCs HSP27磷酸化的作用。     

膜型基质金属蛋白酶-1在黏着斑激酶相关非激酶调控肝星状细胞胶原代谢中的作用

目的： 探讨黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）对纤维连接蛋白（FN）刺激的肝星状细胞（HSC）膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）表达的影响并探讨MT1-MMP在FRNK调控HSC胶原代谢中的作用。方法：应用体外细胞培养技术,脂质体介导法进行FRNK质粒瞬时转染;采用Western blotting法测定FRNK蛋白在瞬时转染时相应的表达,鉴定转染效果;分别应用Western blotting和RT-PCR方法测定MT1-MMP在HSC中的相应表达。结果：FRNK质粒成功转染HSC,于转染48 h时,FRNK蛋白表达最强,P<0.05;FRNK转染后在基因水平上：MT1-MMP mRNA表达明显增加;翻译蛋白水平上：FRNK质粒转染HSC 48 h后,MT1-MMP蛋白表达量显著升高。结论：脂质体介导下FRNK质粒转染,可使外源性FRNK在HSC内大量表达,FRNK可能通过上调MT1-MMP值来抑制HSC胶原合成。     

雌激素对人脐静脉内皮细胞HSP27表达的影响

目的：观察人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中热休克蛋白27（HSP27）表达在雌激素（estrogen,E）诱导下的改变。方法：分别用10–9 M、10–8 M、10–7 M雌二醇（estradiol,E2）以及10–6 M雌激素受体拮抗剂他莫昔芬（tamox ifen）处理HUVEC后,采用Western blot法和RT-PCR法检测HUVEC中HSP27蛋白和m RNA的表达水平。结果：与对照组相比,无论是蛋白水平还是m RNA水平,10–9 mol/L E2对HUVEC中HSP27表达没有明显影响;10–8、10–7 mol/L E2诱导HUVEC中HSP27表达逐渐增加（P〈0.05）;而HUVEC与10–6 M他莫昔芬、10–7 M雌二醇共同孵育,其HSP27水平和单纯10–7 M雌二醇处理相比明显减少（P〈0.05）。结论：外源性E2能诱导HUVEC中HSP27的表达,呈剂量依赖性。他莫昔芬能阻断E2的这种上调HSP27的作用,提示雌激素诱导内皮细胞HSP27的表达依赖ER。     

Klotho对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨延缓衰老基因Klotho对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。 方法 体外条件下培养大鼠骨髓间充质干细胞,构建分泌型Klotho(sKL)过表达的BMSCs。Western blotting检测细胞及培养基中sKL的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Western blotting检测衰老标志物P53、P21蛋白的表达。利用成骨诱导液定向诱导BMSCs向成骨细胞分化,应用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨效果;利用成脂诱导液定向诱导BMSCs向脂肪细胞分化,应用油红O染色鉴定成脂效果。 结果 Western blotting结果显示,sKL组细胞和培养基中sKL蛋白表达显著上调（P<0.05）,P53、P21表达显著下调（P<0.05）;MTT结果显示,各组细胞吸光度值（A值）差别无显著性（P>0.05）,sKL组成骨及成脂能力明显强于对照组（P<0.05）。 结论 sKL增强了大鼠BMSCs的延缓衰老能力,对BMSCs的成骨分化和成脂分化产生一定的促进作用,而对BMSCs的增殖无显著影响。     

LPS和雨蛙肽诱导大鼠离体胰腺组织损伤并抑制HSP60蛋白的变化

目的：观察脂多糖（LPS）、雨蛙肽（cerulein）刺激对大鼠离体胰腺组织热休克蛋白60（HSP60）表达的影响。方法: 分离培养大鼠离体胰腺组织,用低、高浓度cerulein (Cer;10-11mol/L,10-5mol/L)或LPS（10 mg/L,20 mg/L）刺激,以生理盐水（NS）作为对照,在刺激前和刺激后1、4h测定胰腺组织的活力（MTT法）、胰蛋白酶原活性肽（TAP）水平（ELISA测定）,培养上清液中白介素6（IL-6）水平（ELISA测定）;并用 real-time PCR和Western blotting分别测定胰腺组织HSP60 mRNA和蛋白的表达。结果: 低、高浓度的cerulein和LPS刺激胰腺组织后1 h,组织的活力与NS对照组比较稍有下降（P>0.05）,刺激4h后,组织活力明显降低（P<0.05）;组织中TAP水平在高浓度cerulein和低、高浓度的LPS刺激下明显升高;其培养上清液中IL-6水平在刺激后1 h变化不明显,4 h时升高,尤其以高浓度的cerulein或LPS作用显著（P<0.05）。胰腺组织HSP60 mRNA和蛋白的表达量随LPS刺激时间的延长和浓度的升高而降低;而低、高浓度的cerulein刺激HSP60 mRNA的表达增加,但蛋白的表达降低,以高浓度、长时间刺激的作用为明显(P<0.05)。结论: LPS及cerulein对离体胰腺组织具有损伤作用,并呈一定时间及浓度依赖性;同时,胰腺组织HSP60蛋白表达降低,提示HSP60细胞保护作用的减弱可能参与该损伤过程。     

不同人结直肠肿瘤细胞系对常用抗肿瘤药物体外化疗敏感性的比较

 目的：观察5种常用抗肿瘤药物对这些人结直肠肿瘤细胞系的生长抑制作用,探讨5种常用抗肿瘤药物对11株人结直肠肿瘤细胞系的作用强度以及比较其体外敏感性,研究不同抗肿瘤药物对人结直肠癌细胞系HCT116和SW480热休克蛋白27（HSP27）和HSP70表达水平的影响。方法：采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测5种常用抗肿瘤药物分别对11株人结直肠肿瘤细胞系的生长抑制效应,计算50%抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50）及敏感指数,并比较不同人结直肠肿瘤细胞系对5种抗肿瘤药物的敏感性,Western blotting检测HSP27和HSP70蛋白表达水平。结果：11株人结直肠肿瘤细胞系对5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂(OHP)均比较敏感,没有明显耐药性;5株人结直肠肿瘤细胞系对丝裂霉素(MMC)敏感,6株中度敏感;除SW1116 外的10株人结直肠肿瘤细胞系都对多西紫杉醇(DXL)敏感,而SW1116细胞对DXL表现出明显耐药性;除LS174T和SW1116外的9株人结直肠肿瘤细胞系都对伊立替康(IFL)表现出中度敏感,LS174T细胞对IFL表现敏感,而SW1116细胞对IFL表现出明显耐药性。抗肿瘤药物作用于人结直肠癌细胞系HCT116和SW480使HSP27的表达上调,但HSP70的表达水平变化不明显。结论：LS174T是多药敏感细胞株,SW1116是多药耐药细胞株,5-FU和OHP为广谱抗结直肠肿瘤药物;化疗药物的敏感性及HSP27表达量检测对临床选择化疗药物具有一定的提示意义。     

催乳素刺激Jurkat细胞热休克蛋白90的表达及地塞米松的干预作用

目的：探讨催乳素刺激下Jurkat细胞的热休克蛋白（HSP90）的表达状况以及地塞米松对这种表达的影响。方法：以四组不同浓度催乳素（25、50、100、200ng/ml）刺激Jurkat细胞,采用RT-PCR和Western blot检测刺激前后HSP90的表达水平;另将四种不同浓度的地塞米松（10^-9-10^-6mol/L）和高浓度催乳素（100ng/ml）与Jurkat细胞共同孵育,同法检测地塞米松干预后HSP90的表达水平。结果：所有浓度催乳素刺激Jurkat细胞在mRNA和蛋白质水平表达的HSP90均显著高于空白对照组（P〈0.05）,且表达水平随刺激浓度增加而升高,但当浓度高于100ng/ml以上时升高不明显。加入不同浓度地塞米松和高浓度催乳素孵育的Jurkat细胞表达HSP90水平与对照组比较有显著下降（P〈0.05）,且随地塞米松浓度升高而降低。结论：催乳素可刺激Jurkat细胞HSP90的表达,而地塞米松可抑制此效应且有剂量依赖关系。     

GRP78在胃癌生长中的作用*

 目的： 探讨内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78）参与胃癌细胞生长的作用。方法: 回顾性分析34例胃癌及34例癌旁组织,利用组织微阵列技术,构建组织阵列,采用免疫组织化学技术SP法检测该阵列中GRP78蛋白在胃癌及其癌旁组织中表达情况。利用Western blotting检测人体胃癌组织、癌旁组织（肿瘤旁1 cm处）和正常组织（远离肿瘤≥10 cm处）中GRP78蛋白的表达情况。利用Western blotting检测人胃癌细胞SGC7901和过表达GRP78的SGC7901-H78细胞（稳定转染GRP78）中GRP78和生长相关蛋白cyclin D1的表达情况。结果: (1) 免疫组织化学检测发现：人体胃癌组织中GRP78表达水平明显高于癌旁组织和正常组织,且与性别、分化程度相关（P<0.05）; (2) Western blotting检测发现：胃癌组织中GRP78蛋白的表达明显高于癌旁组织和正常组织;(3)  Western blotting检测发现： 相对于SGC7901细胞,SGC7901-H78细胞中GRP78蛋白的表达明显升高,同时检测生长相关蛋白cyclin D1的表达发现,随着GRP78表达的上调,cyclin D1蛋白表达增加。结论: GRP78蛋白的高表达可能参与了胃癌细胞的生长。     

Ac-SDKP经HSP27调节锌指蛋白而抑制肺上皮细胞-间质转化

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是否通过抑制热休克蛋白27(heat-shock protein 27,HSP 27)的表达,进而抑制锌指蛋白SNAI1、SNAI2的表达,而发挥阻抑转化生长因子(TGF)-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞(肌成纤维细胞)的转化以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:激光共聚焦检测TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞转化中HSP27及SNAI1、SNAI2蛋白的共定位表达;real-time PCR法检测HSP27、SNAI1和SNAI2 mRNA的表达;Western blotting法检测HSP27、SNAI1、SNAI2和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,以及转染HSP27干扰质粒后SNAI1、SNAI2蛋白及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,TGF-β1刺激组HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达增强;给予Ac-SDKP干预后,HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达明显降低,差异有统计学意义。用HSP27的干扰质粒转扰细胞后,SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达降低,其中SNAI1和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达与TGF-β1刺激组比较差异有统计学意义。这与Ac-SDKP干预的结果相似。结论:Ac-SDKP能够通过对HSP27表达的调节,降低锌指蛋白SNAI1和SNAI2的表达,进而抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化及胶原蛋白的合成。     

芦荟苷通过降低热休克蛋白70的表达增强顺铂诱导的胃癌细胞凋亡

目的：探讨芦荟苷能否通过降低热休克蛋白70(HSP70)的表达,增强顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。方法：胃癌HGC-27细胞分为对照组、200 mg/L芦荟苷组、5 mg/L顺铂组和两者联合组（200 mg/L芦荟苷+5 mg/L顺铂）。DAPI染色和流式细胞术分别检测细胞凋亡形态改变及凋亡率;RT-qPCR检测HSP70 mRNA的表达水平;Western blot检测HSP70和凋亡相关蛋白的表达;免疫沉淀（IP）检测HSP70的泛素化水平。结果：DAPI染色结果显示,与药物单独刺激组相比,联合组细胞核浓缩与核碎裂现象显著增强。流式细胞术分析细胞凋亡率表明,顺铂组细胞凋亡率为16.71%,显著高于对照组的6.95%(P<0.01)。虽然芦荟苷组与对照组相比,凋亡率无显著差异,但是其与顺铂联合作用后,细胞凋亡率为33.74%,显著高于顺铂和芦荟苷单独刺激组（P<0.01）。RT-qPCR显示,芦荟苷能够显著下调顺铂诱导的HSP70 mRNA表达（P<0.01）。Western blot结果表明,联合组cleaved PARP和cleaved caspase-3/-7的表达...     

临产后子宫体部平滑肌高表达HSP27和αB-crystallin

 ［摘要］目的:研究临产前后子宫体部平滑肌热休克蛋白27（HSP27）和α-晶体蛋白B链（αB-crystallin）的表达变化,探讨其在临产后子宫平滑肌收缩中的可能作用。方法:采用比较蛋白质组学技术鉴定出足月未临产和自然临产人子宫体部平滑肌中HSP27和αB-crystallin蛋白存在差异性表达,应用RT-PCR、免疫组化和免疫印迹方法对临产前后子宫体部平滑肌中HSP27蛋白的表达进行验证。结果:临产后子宫体部平滑肌高表达HSP27和αB-crystallin（P<0.05）。足月未临产和临产人子宫体部平滑肌双向凝胶电泳图谱均存在4个分子量相等、等电点不同的HSP27蛋白斑点,ImageMaster 2D Platinum 软件分析仅有1个HSP27蛋白斑点具有显著差异（P<0.05）,余3个HSP27蛋白斑点无显著差异（P>0.05）。RT-PCR、免疫组化和免疫印迹对HSP27蛋白验证结果与蛋白质组学一致。结论: HSP27和αB-crystallin蛋白在临产后人子宫体部平滑肌高表达,提示这2个小分子热休克蛋白可能参与了临产后子宫体部平滑肌细胞的收缩事件。     

细胞外HSP70/HSP70-PCs对人肝癌HepG2细胞上皮-间充质转化的影响及机制研究

 目的：探讨细胞外热休克蛋白70(HSP70)/HSP70肽复合物(HSP70-PCs)对肝癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响和可能机制。方法：将HepG2细胞分为3组：正常对照组、HSP70/HSP70-PCs组（终浓度2 mg/L）和LY294002+HSP70/HSP70-PCs组。应用real-time RT-PCR与Western blotting法检测上皮细胞表面标志E-cadherin和间质细胞表面标志α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化,以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和缺氧诱导因子1α(HIF1-α)的表达变化。结果：细胞外HSP70/HSP70-PCs可以促进HepG2细胞EMT的发生。HepG2细胞的EMT过程伴随HIF-1α和PI3K表达增加。应用LY294002阻断PI3K后,HepG2细胞没有发生EMT,同时细胞外HSP70/HSP70-PCs上调HIF-1α表达的作用消失。结论：细胞外HSP70/HSP70-PCs可以通过PI3K/HIF-1α促进肝癌细胞发生EMT。     

脂肪特异性蛋白27对大鼠肝星状细胞活化的影响

 目的：探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）对肝星状细胞（HSCs）增殖和活化的影响及其对纤维化相关蛋白的调节作用。方法：从SD大鼠肝脏提取HSCs并培养,采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色和Western blotting检测原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表达。构建携带Fsp27基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h,通过CCK-8比色法检测Fsp27对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,了解HSCs的活化状态;实时荧光定量PCR检测Fsp27对HSCs中纤维化相关蛋白［包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）和转化生长因子β1（TGF-β1）］ mRNA表达的影响。结果：成功分离大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表达差异显著（P<0.01）;活化HSCs成功转染携带Fsp27基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖被明显抑制（P<0.05）;Fsp27促进MMP-2 mRNA的表达（P<0.05）,降低TIMP-1和TGF-β1 mRNA的表达（P<0.05）。结论：Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化,并调节纤维化相关蛋白的表达。Fsp27的作用可能与其维持HSCs静息状态细胞表型有关。     

Proteomic analysis of differential proteins related to the neuropathic pain and neuroprotection in the dorsal root ganglion following its chronic compression in rats

The aim of the study was to identify the differential protein expressions related to neuropathic pain and neuroprotection in the dorsal root ganglion (DRG) following chronic compression of DRG (CCD) in rats. We conducted a proteomics study of L₄ and L₅ DRG after CCD for 28 days. A total of 98 protein spots were detected with significant changes in their expression levels after CCD and 15 protein spots were identified by the matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. Of these proteins, annexin A2, protein kinase C epsilon (PKCε), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (GAPDH), and heat shock protein 70 (HSP70) were up-regulated significantly compared with the normal control. These four proteins and p11, which was annexin A2 light chain, were further examined by Western blotting. The results of Western blotting and the proteomic analysis showed consistent data. Moreover, real-time quantitative RT–PCR experiments indicated that CCD-induced increase in protein levels was associated with an up-regulation of annexin A2 and PKCε gene expression. In conclusion, this study highlights the molecular process in DRG underlying neuropathic pain. CCD is associated with the up-regulation of annexin A2 and PKCε and their related genes. The up-regulation of GAPDH and HSP70 suggests that there exist concurrent processes of nervous injury and neuroprotection in the course of neuropathic pain.     

The expression of heat shock protein 27 in retinal ganglion and glial cells in a rat glaucoma model

The heat shock protein 27 kDa (HSP27) is a member of proteins that are highly inducible under various forms of cellular stress. This study describes constitutive HSP27 expression in rat retina and stress-associated expression of HSP27 in an experimental rat glaucoma model. Glaucoma was induced unilaterally using laser photocoagulation of the episcleral and limbal veins. Three and seven days after the elevation of intraocular pressure (IOP), groups of rats were killed. The second laser treatment was performed for those rats killed 14 and 21 days after the first laser treatment. The RGCs were labeled with a retrograde tracer 7 days before kill. The expression of HSP27 was analyzed by Western blotting in retinas of rats killed on day 14 after the first laser treatment. Retinal astrocytes, Müller cells and HSP27-positive cells were visualized using immunohistochemical methods both from retinal whole-mounts and paraffin sections. The total number of retrogradely labeled RGCs decreased by 23.2% after 7 days, 28% after 14 days, and 29.3% after 21 days of elevated IOP when compared with controls. A significant decrease of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-immunoreactive retinal astrocytes in laser-treated eyes was observed compared with the controls (accounted for 44.9%, 38.2% and 35% of the control values in the 7-day, 14-day and 21-day groups, respectively). The expression of HSP27 in RGCs and retinal astrocytes was also increased in laser-treated eyes when compared with controls in all groups. However, glycinergic and cholinergic cells in the inner nuclear layer and the highest number of RGCs and astrocytes that expressed HSP27 were found in the 14-day group of rats. The constitutive expression of HSP27 was observed only in retinal astrocytes and Müller cells. This study suggests that constitutive HSP27 expression is a cell-type specific phenomenon in the rat retina. However, at the same time, HSP27 might be considered as a marker for neuronal injury in the rat glaucoma model.     

shRNA介导的hWAPL表达沉默对人宫颈癌CaSki细胞增殖与凋亡的影响

 目的： 为探讨人半翼(hWAPL)蛋白在细胞增殖与凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究用RNA干扰技术抑制hWAPL基因的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞CaSki细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法：实时荧光定量PCR和Western blotting 检测hWAPL shRNA的干扰效率;MTT检测细胞增殖;Annexin V-PE和 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;蛋白质印迹分析凋亡蛋白cleaved caspase-3和细胞周期抑制蛋白p21、p27的表达。裸鼠荷瘤模型体内研究hWAPL沉默对CaSki细胞增殖的影响。结果：实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果表明,筛选到的hWAPL shRNA能有效抑制内源hWAPL的表达。MTT实验表明 shRNA介导的hWAPL表达沉默显著抑制CaSki细胞的增殖。Annexin V-PE分析结果表明, hWAPL 沉默增加了凋亡细胞数目。细胞核经Hoechst　33258染色出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光; 蛋白质印迹结果显示cleaved caspase-3、 p21和p27表达增加;裸鼠成瘤实验表明,hWAPL 沉默的肿瘤体积减小,增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达增加。结论：hWAPL沉默抑制CaSki细胞增殖,促进细胞凋亡,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。     

重组蛋白PTD-HSP27的制备及其穿细胞膜和角膜组织的功能研究

目的:制备PTD-HSP27蛋白并研究其能否穿过人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞膜及新西兰大白兔的角膜组织进入眼前房。方法:利用重叠延伸PCR法获得重组目的基因片段PTD-HSPB1-6His,构建重组质粒p KYB-PTD-HSP27-6His,原核诱导PTD-HSP27蛋白表达及纯化重组蛋白后对其进行Western blotting鉴定;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组蛋白PTD-HSP27并检测其穿透SRA01/04细胞膜的能力及兔眼角膜组织的能力。结果:成功构建并纯化制备目的蛋白PTD-HSP27,在PTD-HSP27孵育后的SRA01/04细胞及结膜囊滴注PTDHSP27兔眼前房内均可检测出重组蛋白PTD-HSP27。结论:通过重叠延伸PCR法及镍柱层析纯化法可以获得较纯的重组蛋白PTD-HSP27;重组蛋白PTD-HSP27能够穿透SRA01/04细胞膜及穿越兔眼角膜进入房水。