间充质源性软骨种子细胞与脱细胞软骨复合培养构建软骨组织

目的兔外周血间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养,构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。方法提取兔外周血间充质干细胞,行体外诱导培养14 d获得软骨种子细胞,显微镜下观察细胞生长特性,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。联合去垢剂—酶法获得兔脱细胞肋软骨支架,软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨支架体外复合培养7 d获得复合软骨,脱细胞软骨及复合软骨固定后行扫描电镜观察及组织学HE、甲苯胺蓝染色。结果兔外周血间充质干细胞体外诱导培养14 d,胞浆内较多软骨细胞特异性Ⅱ型胶原分泌;兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分,其孔隙率(61.31±8.45)%,孔径长度(32.80±5.15)μm。支架与软骨细胞黏附良好,并伴有多量基质分泌。结论间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可构建新型软骨组织,本研究为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。     

Ⅱ型胶原糖胺聚糖复合支架对 hUCM SCs成软骨诱导的实验研究

目的：探讨以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）作为软骨组织工程种子细胞,Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料作为细胞载体及其细胞‐支架复合体成软骨的可行性。方法制备Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖多孔支架,电镜观察测定支架材料的孔径、孔隙率和亲水性,对支架材料进行相应的组织学分析。培养鉴定 P3代的hUCMSCs ,将hUCMSCs混悬液接种到Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架上,不加诱导剂进行培养,3周后取出样品行甲苯胺蓝、番红精O染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果第3代hUCMSCs高度表达CD29、CD105等间充质细胞标志,几乎不表达CD34等内皮细胞、造血细胞标志。Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料呈白色多孔泡沫状,孔隙率为（91．8±2．17）％,孔径110～230μm ,分布均匀,相互贯通。吸水膨胀率为（213．71±1．31）％,亲水性良好。甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。细胞‐支架复合体在培养过程中可观察到有软骨样组织形成并逐步增多,甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性,电镜观察显示细胞在支架上增殖活跃,与材料黏附紧密,可见软骨样细胞及其周围大量交错连接的胶原纤维。结论 hUCMSCs与Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料复合,可在体外不经诱导而初步构建组织工程软骨,为软骨损伤的修复奠定了一定的实验基础。     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯支架复合同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯(PHBV)三维多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性及有效性.方法:采用"压片-热处理-粒子析出技术"制备PHBV多孔支架.体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养4周,期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况,然后与单纯PHBV支架同时植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察.进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果.结果:电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质,组织学观察示PHBV支架浅层有新生软骨组织形成,于4周后开始形成透明软骨样结构且表面基本平整与宿主整合良好,组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性Ⅱ型胶原. 结论:PHBV可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损.     

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪-壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪-壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

兔骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的体外诱导兔骨髓基质干细胞（BMSC）向软骨细胞定向分化，并对分化后的细胞进行鉴定。方法选用16周新西兰大白兔，于胫骨或股骨抽取骨髓，经梯度离心、培养、扩增，取第3代BMSC按一定比例种植于6孔板中，并加入含有转化生长因子β1、地塞米松和维生素C的培养液、于不同时间点取材固定，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴别、结果诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性；II型胶原免疫组化阳性。结论在本实验条件下，获取的兔BMSC生长稳定、增殖快，并成功地诱导其向软骨细胞表型转化。     

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法

目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法.方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况.结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞.Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%.在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布.结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法.     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用

目的探讨结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用。方法制备不同浓度的结核菌上清液(TB-SN),分别与肿瘤细胞株HePG2(肝癌)和A549(肺癌)进行反应。应用特异性荧光探针LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒检测肿瘤细胞的生长情况,应用Vybrant凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果与5%TB-SN反应5 d后,HePG2和A549细胞凋亡显著增加;与TB-SN反应后,HePG2和A549细胞生长受到抑制。结论结核菌素可以介导肝癌和肺癌肿瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的生长。